第四节　血管壁细胞的培养和鉴定

　　动脉粥样硬化病灶主要涉及两类血管细胞即血管内皮细胞和中膜平滑肌细胞（SMC），本节主要就这两类细胞进行讨论，介绍一般培养和鉴定方法。

　　一、血管内皮细胞的培养方法和特性

　　人和动脉不同部位、不同血管如大动脉与小动脉、毛细血管，以及静脉血管之间存在差异，在处理这些细胞时应分别对待。血管内皮细胞形态较小，近似圆形，呈均匀排列，一般取材于人和动物的脐带。

　　1．人大动脉内皮细胞培养

　　人大动脉内皮细胞可来自手术、病理活检组织，也可来自尸体（需在死后24h内取材），在取材过程中应注意无菌操作。

　　（1）方法：小心剥除已游离的大血管外膜，置于盛有冷的磷酸盐平衡盐溶液平皿中反复漂洗，洗净血管内、外面的血液和脂质，然后剪开血管，放入37℃消化液中，60min，消化结合后，用23号针头注射器吸取消化液冲洗血管内腔，最后收集消化液置无菌试管中，离心（1000rpm 7min）弃上清，加入含血清培养基中，使细胞重新悬并调整细胞数，接种于相应大小培养瓶或培养皿中，37℃恒温温箱培养，一周后内皮细胞可长成单层，呈多角形铺成石状排列。

　　（2）注意事项：①如果小于23号针头则回收内皮细胞效果差，若针头过大则注射器内压大会吸入紧贴内皮细胞的平滑肌细胞，因此注意使用恰当的针头；②人血管内皮细胞对营养条件要求高，是依赖于生长因子的一种细胞。常用的培养基为RPMi 1640，培养时添加15% FBS，15%Nu-Serum，5～20μg/ml的内皮细胞生长因子（ECGF）以及100μg/ml的肝素。改进的培养基有MCDB109培养基，市场上也有内皮细胞商品培养基，可根据需要选择购买；③培养基中必须加入相应抗生素，最终浓度：庆大霉素为15μg/ml，氨苄青霉素为50μg/ml，二性霉素B1～2μg/ml，二甲胺四环素1μg/ml。在48h内可以防止细胞感染，3日后还应添加庆大毒素。此方法也适用于人大静脉内皮细胞的培养，但静脉壁薄，操作困难，细胞容易老化。

　　2．高度动脉硬化的血管内皮细胞的培养动脉硬化血管内皮细胞培养，对培养基的要求同正常内皮细胞，技术关键是分离细胞。动脉硬化内皮细胞层混有脂肪斑化，粥样肿胀的巨噬细胞。除去这种巨噬细胞最有效的方法是利用内皮细胞和巨噬细胞比重的差异，通过离心的方法达到分离的目的。通常用淋巴细胞分离液，首先经消化液处理，将所得内皮细胞的沉渣放入不含血清的8mlRPMi 1640液再漂浮后，预先在另一试管加入5ml淋巴细胞分层液（比重1.0717），再将细胞轻轻加入。加完后，800xg，23℃离心30min，内皮细胞沉着于管底，巨噬细胞漂浮于上层。

　　3．脐带静脉内皮细胞培养

　　在婴儿出生时立即将脐带放置于无菌的500ml磷酸盐溶液（PBS）中低温保存。次日分离细胞。脐带有一根静脉两根动脉，通常用内腔大静脉。将洗净的静脉一端用夹子夹紧，一端注入消化液，静置孵育片刻。然后PBS或培养液反复抽吸内腔，收集后与消化液一并离心、沉淀内皮细胞。所用培养基与大动脉内皮细胞培养基相同，脐带静脉内皮细胞、大动脉内皮细胞易于培养，既使不加生长因子在最初几代细胞也会增殖良好。

　　二、血管内皮细胞特性

　　1．血管内皮细胞重要标志

　　（1）第Ⅷ因子关连抗原（von willebrand factor,VWF），可以由全身所有血管内皮细胞产生，检测这一因子主要用相应抗体。VWF有其特异性，人的VWF抗体对牛的内皮细胞没有交叉反应。兔疫荧光间接法测定该因子，阳性细胞出现细长的荧光颗粒，在核周围的颗粒较密，细胞边缘颗粒较少。

　　（2）Weibel-Palade小体，该小体是血管内皮细胞又一特异性的标志。电子显微镜下，呈现0.1～0.3μm,长0.5～5μm的椭圆形棒状结构。上述的VWF就是该小体产生的。

　　2．培养的大动脉内皮细胞形态

　　培养的内皮细胞从形态学上可分为两类。其一，占培养内皮细胞的大部分，直径在50～70μm，类圆形或多角形的小型细胞，这一类被称为典型内皮细胞，呈单层铺路石样排列，占婴幼儿、青少年血管内皮细胞的大部分。另一类是直径在100～200μm的大型内皮细胞，这类细胞通常带有两个以上的细胞核，被称为非典型内皮细胞。非典型内皮细胞是成人的大动脉内皮细胞，与动脉硬化和老化有关。

　　一般来说，血管内皮细胞随着年龄的增加，使典型的内皮细胞慢慢地转变为非典型内皮细胞；年龄越大，非典型的内皮细胞含量越高。细胞生长方面，动脉内皮细胞比静脉内皮细胞增殖能力强，婴幼儿血管内皮细胞比成人或高龄者内皮细胞生长能力强，体外培养的这两种细胞与对照组细胞间存在显著差异。