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第十八章 血清载脂蛋白的免疫测定

  血浆中蛋白质种类繁多,对各种单一蛋白进行快速而又特异的定量。目前公认的方法是免疫测定法,即利用其特异的抗体,采用测定抗原抗体复合物的方式定量。血浆(清)中载脂蛋白是以脂蛋白形式存在的少量蛋白,在解联剂作用下,使载脂蛋白从脂蛋白中分离出来,再利用相应的载脂蛋白抗体进行测定。

  载脂蛋白的免疫测定方法很多,目前采用的方法各有其特点,所需条件也有差异,现将医学检验中常用的定量方法作一简要介绍。

第一节 血清载脂蛋白定量的方法学及其参考值的评价

  一、载脂蛋白测定方法

  1.单向免疫扩散法(radial immunodiffusion,RID)

  该法较简单,一般实验室均可进行。消耗较多的抗血清,扩散过程至少24h,最多需72h,测定下限值为10μg/ml。该方法虽然简单,应严格控制有关条件如:含抗血清的琼脂糖凝胶厚度要均匀;加入小孔的稀释抗原(血清)量要准确;含ApoB的脂蛋白如VLDL和LDL颗粒大小不一,如琼脂糖凝胶浓度在1.5%~2.0%,可能仅测出LDL的ApoB,大颗粒的LDL及VLDL的ApoB可能无法测出,因为难以穿过琼脂糖凝胶的孔隙。另外,扩散过程中,凝胶板一定要水平,否则易使扩散环呈椭圆形,难以准确测量直径。一般使沉淀环以3.5~10.0mm为宜,应在两个方向测量直径,其精度要求达到0.1mm。采用五种不同浓度参考值,测定沉淀环面积对相应浓度关系以曲线回归方程作图。

  2.电免疫测定法(electroimmunoassay,EIA)

  该法灵敏,抗血清用量少,如琼脂糖缓冲液中加入聚乙二醇及甘氨酸,其电泳时间可缩短一倍,火箭峰高以1~4cm为宜,火箭峰的测量可以计算面积或峰高,峰高从中心量起。测量精度最好能在0.1mm,灵敏度约2μg/ml,又称为火箭电泳法。

  3.免疫比浊法(immunoturbidimetry assay,ITA)

  简便快速,在自动分析仪进行操作并能批量检测,是目前临床使用最多的方法学。免疫比浊法有两种:一是测定光散射的,又名免疫散射比浊法(INA);需用特殊的激光浊度仪;另一种是利用光度计测定通过混浊溶液后的透光强度,称为透射免疫比浊法(ITA),其灵敏度低于INA。比浊法可以终点法和速率法测定,速率法是根据散射光强度与时间的关系,以微机处理计算出抗原抗体复合物形成的最大反应速度,后者与溶液中抗原量成正比,常可在1min内完成测定过程,可自动扣除空白;终点法比速率法稳定,一般多用终点法。

  4.酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)

  该技术已广泛应用于极微量蛋白的定量测定,可测出ng级水平的抗原或抗体含量,该法可用于ApoE、C-Ⅱ、C-Ⅲ等含量较少的载脂蛋白的定量测定。

  5.放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)

  该法灵敏,抗血清用量少,所需设备较多,一般用125I标记抗原作为示踪物,除ApoC-Ⅰ(不含酪氨酸)以外,都可以作碘标记(氯胺T法),以双抗体法测定RIA法可检测最低至3~5ng。临床检验中不常用此法,主要用于动物实验的科学研究工作。

  还有荧光免疫法和化学发光法等灵敏度很高的方法。

  血清载脂蛋白测定的方法,从测定原理、方法学评价及参考值,刘秉文和李健斋等人作了大量的工作,为国内的载脂蛋白测定的临床应用奠定了基础。周新曾于1986年首先在国内研制成功抗人ApoB100血清,其后,国内同仁陆续研制出ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、E、CⅡ、CⅢ抗血清,并广泛应用于临床的疾病诊断,在部分大医院已成为常规检查项目。

  刘秉文在“脂蛋白与动脉粥样硬化“一书中全面总结了国内外载脂蛋白测定的方法学及其参考值,本节将引用如下比较表:

表18-1 ApoAⅠ免疫测定法的比较

  RIA ELISA EIA RID INA ITA
抗体 P,M P,M P P,M P P
灵敏度(n) 0.3~10 0.1~0.5 100 100 150 100
测定范围(ng) 1~200 0.5~15 100~500 200~800 200~500 200~600
批内CV(%) 3~9 4~8 3~5 6 3~7 1
批间CV(%) 5~10 8~10 3~9 10 6~7 6
正常值(g/L) 1.0±0.2 1.5±0.2 1.2±0.2 1.2±0.1 1.2±0.2 1.7±0.2

  P:多克隆抗体;M:单克隆抗体;RIA:放射免疫法;ELISA;酶联免疫法;RID:单向免疫扩散法;INA:免疫散射比浊法;ITA:免疫透射比浊法。

  (源自:刘秉文,1995.)

表18-2 ApoAⅡ免疫测定法的比较

  RIA ELISA EIA RID INA ITA
抗体 P P,M P P P P
灵敏度(g) 0.5   20 5 30 20
测定范围(ng) 1~20 5~50 30~60 50~400 50~900 40~150
批内CV(%) 7 8 5 5 5 5
批间CV(%) 9 7 8 - 7 6
正常值(g/L) 0.25±0.4 0.35±0.05 0.76±0.2 0.29±0.02 0.37±0.09 0.36±0.03

  (源自:刘秉文,1995.)

表18-3 ApoAⅣ免疫测定法的比较

  RIA ELISA EIA
抗体 P P P
灵敏度(g) 5 0.2 20
测定范围(ng) 5~50 0.5~8 50~200
批内CV(%) 5 3.60 5
批间CV(%) 7 8 9
正常值(g/L) 0.17±0.03 0.14±0.05 0.14±0.04

  (源自:刘秉文,1995.)

表18-4 ApoB100免疫测定法的比较

  RIA ELISA EIA RID INA ITA
抗体 P,M P,M P P,M P P
灵敏度(n) 5~10 2~20 50~300 300 300 300
测定范围(ng) 0~100 2~10 20~500 50~600 300~500 100~500
批内CV(%) 4~8 4~7 1~7 3~7 4~7 2
批间CV(%) 7~11 10 3~10 6~7 7~8 2
正常值(g/L) 0.9±0.2 0.85±0.1 0.6±0.3 0.8±0.2 0.8±0.2 0.8±0.3

  (源自:刘秉文,1995.)

表18-5 ApoCⅠ免疫测定法的比较

  RIA ELISA INA
抗体 P P P
灵敏度(n) 1 5 50
测定范围(ng) 5~30 15~100 -
批内CV(%) 7 3 5
批间CV(%) 9 5 8
正常值(g/L) 0.05±0.03 0.06±0.002 0.06±0.01

  (源自:刘秉文,1995.)

表18-6 ApoCⅡ免疫测定法的比较

  RIA ELISA EIA RID ITA
抗体 P P P P P
灵敏度(g) 10 0.3 45 40 10
测定范围(ng) 10~80 0.5~5 70~600 40~600 12~50
批内CV(%) 6 3 6.5 2.1 3.3
批间CV(%) 10 8 8.2 3.9 6.2
正常值(g/L) 0.04±0.01 0.033±0.008 0.04±0.002 0.039±0.017 0.04±0.01

  (源自:刘秉文,1995.)

表18-7 ApoCⅢ免疫测定法的比较

  RIA ELISA EIA RID INA ITA
抗体 P P P P P P
灵敏度(g) 1 0.3 10 76 20 15
测定范围(ng) 2~20 1~6 20~80 76~600 50~400 30~120
批内CV(%) 13 4.3 8 2.5 6.3 5.2
批间CV(%) 13 4.3 8 3.5 6.3 5.2
正常值(g/L) 0.15±0.06 0.16±0.03 0.12±0.04 0.127±0.037 0.12±0.03 0.11±0.03

  (源自:刘秉文,1995.)

  二、人血浆(清)载脂蛋白参考值比较

  刘秉文于1995年对国人血浆(清)各项载脂蛋白参考值与国外参考值作了详细的比较,其报道见表18-9、18-10、18-11、18-12、18-13、18-14、18-15。

表18-8 ApoE免疫测定法的比较

  RIA ELISA EIA RID ITA
抗体 P P,M P P P
灵敏度(n) 0.2~8 0.5 20 35 5
测定范围(ng) 0.8~100 0.5~6 20~200 50~300 20~400
批内CV(%) 6 4 8 5.9 2
批间CV(%) 9 8 5 7.2 5
正常值(g/L) 0.05±0.02 0.04±0.01 0.10±0.04 0.035±0.01 0.04±0.01

  (源自:刘秉文,1995.)

表18-9 国人血浆ApoAⅠ含量与国外报道的比较

作者 发表时间 方法 例数 性别 年龄 均值±s(mg/dl)
张祖辉 1998 RID 307 20-77 122.1±13.7
刘秉文     318 20-77 125.5±15.9
李键斋等 1986 EIA 291 男+女 19-50 119±17
周新等* 1990 EIA 692 13-85 129.1±16.1
477 18-80 130.5±14.2
Albers等 1976 RID 20 男+女 11.5±7.3 115.7±7.3
Cheung等 1977 RID 172 20-65 120±20
188 20-65 135±25
Reman等 1978 RID 95 40-49 137±23
104 40-49 137±23
Schonfelcl等 1974 RIA 41 13-58 100±35
34 16-58 104±34
Karlin等 1976   23 20-39 130±3
19 20-39 154±6
Avogaro等 1978 EIA 60 20-60 128±22
60 20-60 134±20
Mordasini等 1980 EIA 50 20-60 113±9
50 20-60 125±17
Miller等 1980 EIA 8 34-70 122±27
8 52-68 149±20
Rosseneu等 1981 IAN 12 29 139±15
14 30 147±24
Assmann等 1982 INA 3032 20-65 136±23
1367 20-60 146±25

  (源自:刘秉文,1995)

  *:作者补充。

表18-10 国人血浆ApoAⅡ含量与国外报道的比较

作者 发表时间 方法 例数 性别 均值±s(mg/dl)
罗静聪 1988 RID 76 男+女 26.7±4.6
刘秉文 1988 ELISA 41 男+女 24.2±5.9
胡维诚 1987 RID 160 男+女 27.0±4.4
Curry等 1976 RID 19 78.0±1.7
      19 83.0±25
Cheung等 1977 RID 172 33.0±5
      188 36.0±6
Assmann等 1977 EIA 15 34.1±5
      15 38.3±5.5
Schonfeld等 1977 RLA 29 男+女 40.5±8.9
Maupovic等 1981 ELA 50 男+女 68.0±18
Goldberg等 1980 RIA 50 25.0±1
      50 26.0±1
De Backnev等 1982 INA 70 男+女 43.0±6.9
Zech等 1983 RID 27 男+女 24.0±0.6
Noma等 1983 RLA 27 男+女 32.0±8.3
Nukita等 1984 EIA 156 男+女 40.0±9

  (源自:刘秉文,1995)

表18-11 国人血浆ApoB含量与国外报道的比较

作 者 发表时间 方法 例数 性别 均值±s(mg/dl)
周新等 1986 EIA 608 83.2±13.9
      511 80.4±13.4
李健斋等 1986 EIA 727 男+女 76±19
吴兆丰、刘秉文 1987 RID 304 87.9±14.4
      320 86.7±14.4
Albers等 1975 RIA 349 男+女 81.0±20
Bantorich等 1975 RIA 82 男+女 90.0±24
Bedford等 1976 RIA 128 男+女 87.0±30
Schonfeld等 1974 RIA 42 男+女 83.0±16
Brussaard等 1980 EIA 60 男+女 63±16
Fruchart等 1981 EIA 144 男+女 90
Curry等 1978 EIA 38 90±2.0
      36 88±11
Curry等 1978 RID 20 男+女 87±26
Lees等 1970 RID 64 男+女 83±25
Snuderman等 1975 RID 31 82±22
Fievet等 1979 INA 206 129±31
      271 120±34
Heuck等 1979 INA 68 男+女 82.0±23
Rossenue等 1981 INA 70 92±13
Durrington等 1976 INA 29 男+女 85±11

  (源自:刘秉文,1995)

表18-12 国人血浆ApoCⅠ含量与国外报道的比较

作 者 发表时间 方法 例数 性别 均值±s(mg/dl)
傅明德等 1987 ELISA 202 7.6±2.5
      214 8.0±2.3
Polz等 1980 RID 10 男+女 6.9±2.0
Curry等 1981 ELA 68 男+女 6.0±1.5

  (源自:刘秉文,1995)

表18-13 国人血浆ApoCⅡ含量与国外报道的比较

作 者 发表时间 方法 例数 性别 均值±s(mg/dl)
傅明德等 1987 ELISA 202 5.2±1.9
      241 4.9±1.8
范萍等 1989 RID 67 男+女 3.9±1.7
Schonfeld等 1979 RIA 93 男+女 3.9±1.4
Curry等 1981 EIA 68 男+女 4.0±2.0
Kashyap等 1977 RIA 32 男+女 5.0±0.4

  (源自:刘秉文,1995)

表18-14 国人血清ApoCⅢ含量与国外报道的比较

作者 发表时间 方法 例数 性别 均值±s(mg/dl)
傅明德等 1988 ELISA 134 11.6±3.6
      135 12.0±3.7
范萍等 1989 RID 67 男+女 12.7±3.7
刘秉文等 1987 IRA 21 男+女 9.2±2.1
Schonfeld等 1979 RID 93 男+女 15.4±6.2
Curry等 1980 ELA 54 男+女 10.9±3.0
Kashyap等 1981 RIA 29 男+女 11.1±0.9

  (源自:刘秉文,1995)

表18-15 国人血浆ApoE含量与国外报道的比较

作  者 发表时间 方法 例数 性别 均值±s(mg/dl)
刘铭锋、刘秉文等 1987 ELISA 42 男+女 3.57±1.24
刘铭锋、刘秉文等 1987 ELA 50 男+女 4.70±1.18
刘铭锋、刘秉文等 1992 RID 116 3.95±0.98
      122 4.00±1.32
张东升、夏辉明 1991 ELISA 25 男+女 3.45±1.24
Blum等 1980 RIA 26 男+女 3.6±1.3
Gregg等 1984 RIA 12 男+女 4.8±1.2
Wesgraber等 1984 RIA   男+女 5(3.5-7.0)

  (源自:刘秉文,1995)

  王抒、李健斋等于1996年报道283例血清各项载脂蛋白测定值及百分位数,如表18-16、18-17、18-18所示。这批数据是目前国内采用同一份标本检测脂质、脂蛋白和载脂蛋白项目最多的1次报道。除了作为参考值供临床应用外,并阐明了各项指标之间的相关性。笔者予以抄录,供参考。

表18-16 血脂与脂蛋白水平(mmol/L)

项目 男(225例) 女(58例) P值
TC 4.87±0.73 5.16±0.84 <0.05
TG 1.27±0.66 1.25±0.71 >0.05
HDL-C 1.41±0.35 1.54±0.36 <0.02
HDL2-C 0.56±0.17 0.63±0.19 <0.02
HDL3-C 0.86±0.23 0.91±0.19 >0.05
LDL-C 2.95±0.68 3.13±0.12 >0.05

  (源自:王抒,1996)

表18-17 几项常用比值*

项 目
LDL-C/HDL-C 2.21±0.72 2.16±0.80
HDL2-C/HDL3-C 0.66±0.12 0.69±0.15
ApoB/ApoAⅠ 0.72±0.16 0.74±0.17
ApoAⅠ/ApoAⅡ 4.10±0.65 4.10±0.68
ApocⅡ/ ApoCⅢ 0.39±0.12 0.41±0.16

  男女组间无显著意义

  (源自:王抒,1996)

表18-18 各项载脂蛋白测定值与百分位数

项目 X±S p5 p25 p50 p75 p95
男(225例)            
ApoAⅠ(g/L) 1.42±0.17 1.17 1.30 1.43 1.51 1.72
ApoAⅡ(g/L) 0.36±0.66 0.28 0.32 0.35 0.40 0.46
ApoB(g/L) 1.01±0.21 0.72 0.86 1.00 1.14 1.38
ApoCⅠ(mg/L) 53±17 31 43 50 60 83
ApoCⅡ(mg/L) 34±16 13 24 31 42 69
ApoCⅢ(mg/L) 44±17 26 34 41 51 74
ApoE(mg/L) 44±17 26 34 41 51 74
Lp(α)(mg/L) 144125 26 53 107 185 382
女(58例)            
ApoAⅠ(g/L) 1.45±0.14 1.21 1.34 1.44 1.55 1.74
ApoAⅡ(g/L) 0.36±0.06 0.26 0.33 0.36 0.39 0.44
ApoB(g/L) 1.07±0.23 0.71 0.90 1.08 1.20 1.49
ApoC(mg/L) 53±18 30 39 51 61 92
ApoCⅡ(mg/L) 41±18 20 28 38 49 77
ApoCⅢ(mg/L) 104±40 52 72 100 129 184
ApoE(mg/L) 51±18 33 37 48 58 89
Lp(α)(mg/L) 154±116 35 66 117 207 464

  国内的已有报道表明,人血清载脂蛋白参考值水平尚有一定的差异。引起这种差异的原因是多方面的,目前认为主要原因有:①检测方法与仪器不同;②试剂质量尤其是抗血清技术标准不统一;③国内尚未采用完全符合国际标准的定值血清;④人群的生活习惯及种族差异。为此对于国人的血清载脂蛋白参考值的确立,尚需付出艰辛的劳动。