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  三、HFRS动物模型的研究和应用

  肾综合征出血热病毒(HFRSV),属布尼亚病毒科(Bungavividae)中的一个新属,称为汉坦病毒属。自1978年南朝鲜李镐汪首次以疫区黑线姬鼠肺分离到HFRSV(亦称汉坦病毒Hantaan Virus,HTNV)后,对其动物模型进行了众多的研究。

  (一)HFRS感染动物模型

  感染动物模型的亚临床感染,亦无明显病理变化,主要用于病毒分离和传代。目前有:非疫区黑线姬鼠、大白鼠、长爪沙鼠、家兔等。

  1.黑线姬鼠

  非疫区黑线姬鼠是最早用于病毒分离和实验研究的动物。据报道用各种途径(肌肉、皮下、肺内、鼻内、或经口)接种均可使黑线姬鼠感染。皮下和肺内接种0.1ml汉坦病毒或待检其其它材料后,10天左右肺部出现病毒,以后在肾、肝、颌下腺中可检出病毒。约接种后20天,肺中病毒滴度最高,以后逐渐下降,但150天后仍可检出。

  黑线姬鼠为野生鼠类,常有野生啮齿类病毒的污染,加之来源、人工饲养、繁殖等问题较难解决,因而使用受到一定限制。

  2.大鼠成鼠

  1981年Leepw等将朝鲜出血热病毒接种到雌性、1月龄Wistar和Fisher大鼠。这是首次将该病毒接种于实验大鼠,肌肉接种0.5ml汉坦病毒后14-65天,肺内可发现其特异性抗原;接种后三周,血清中可检出特异性抗体,除脾脏亦可查到特异抗原外,与黑线姬鼠脏器的抗原分布相同。

  朝鲜出血热病毒对实验室大鼠的适应,提供了无野生啮齿类病毒污染的实验模型。现已应用于特异性药物治疗研究。

  3.长爪沙鼠成鼠

  1983年朱智勇等发现长爪沙鼠对HFRSV敏感。六种途径(肺内、皮下、腹腔、口腔、肌肉)接种,第1代即可感染,无需传代适应;脏器内检出特异性荧光部位与黑线姬鼠相同。接种病毒后4天,肺组织中查见病毒抗原,5-7天过高峰,通常于10-14天消失。接种后8天,查到抗体,14天达高峰。长爪沙鼠可用多种宿主动物体内HFRSV的分离,且在较短时间内即可获得毒株。而且,这些毒株可用于疫苗的研制。

  4.家兔

  HFRSV感染的家兔,与长爪沙鼠成鼠一样,亦为无症状短期自限性隐性感染。不同来源的HFRSV,除口饲外,肌肉、腹腔、肺内、皮下接种均可使家兔感染,并能在体内连续稳定地传代,但不表现任何症状。接种后4天,有持续数天的病毒血症,7-14天可在多种器官内找到病毒抗原,以脾、小肠、胰腺中为明显,肺、肝、肾等组织内偶尔可见,8-9天抗原量最多,同时在血液中开始查到相应抗体,随抗体效价增长体内病毒抗原很快减弱,至第15天完全消失。

  初步实验表明,R3和76/118株都能使乳兔感染,其表现与成兔相似,全身多种脏器组织内可检出病毒抗原,但其荧光亮度更强,提示乳兔对HFRSV更敏感。

  (二)HFRS致病动物模型

  致病动物模型为显性感性甚至死亡,并伴有明显病理改变。主要用于发病机理研究、药物筛选等。目前有小白鼠乳鼠、大鼠乳鼠、裸鼠及环磷酰胺处理的金黄地鼠。

  1.小鼠乳鼠

  Tasi等报道了第一个致病动物模型,即新生小白鼠(2-4龄)。相继发现CD-1、ICR、Balb/等品系乳鼠均对HFRSV敏感。颅内、腹腔、肌肉、皮下接种均可使其感染。我们的研究发现:颅内、腹腔联合接种与单纯颅内接种,在发病时间、抗原分布上无明显差别。但腹腔接种乳鼠发病时间要比脑腹联合接种及单纯脑内接种平均迟4-5天。病毒抗原广泛分布各脏器(脑、心、肝、脾、肺、肾、胸腺),脑内接种0.02ml经乳鼠传代适应的汉坦病毒76/118株(LD50、10-6·5/0.02ml),乳鼠第7天开始发病,表现为蜷缩、活动减少、耸毛、弓背、尾强直、后肢麻痹,直致死亡,发病规律。

  乳鼠现已成功地用于病毒分离、繁殖高滴度HFRSV,并被用于研究不同来源毒株的毒力及测定疫苗效力和安全性、筛选抗病毒药物及研究发病原理。

  2.大鼠乳鼠

  Fishet大鼠(E344/N)出生后24小时内,分别颅内接种HFRSV76/118株和B-1株(分离自实验室大鼠),死亡率分别为18.8%、42.9%。腹腔分别接种上述两种毒株,观察至第50天,仍未见死亡。

  3.金黄地鼠

  每只地鼠腹腔一次注射200mg/kg环磷酰胺,48小时后,腹腔或皮下注射病毒悬液1ml,或脑内接种0.05ml。绝大多数动物在感染后7-9天病死。在病死地鼠的各器官均发现有HFRS病毒抗原,并分离到病毒。各器官的病理变化酷似人体出血热病变。

  4.裸鼠

  14-42天龄的CK-1无胸腺裸鼠,脑内接种104·4PFU(0.02ml)汉坦病毒76/118株后40天,表现有体重减轻、活动减少、站立不稳、嗜睡等,最后全部死亡。而其同龄同窝兔功能正常鼠不发病。

  我们用乳鼠适应的汉坦病毒76/118株感染了21日龄NIH品系的无胸腺裸鼠,感染剂量2.5×105LD50,(脑腹联合接种,0.02ml/脑,0.05ml/腹)。最早于第8天开始发病,表现为活动减少、互相抱团、食欲减退、体重减少、弓背、后肢麻痹,于20天内全部死亡。而接种相同量病毒的同窝免疫功能正常鼠则不发病。脑、心、肝、脾、肺、肾均有特异抗原,脑内抗原荧光最亮。初步观察了人白细胞干扰素对裸鼠感染的保护作用,剂量为:20×106μ/kg,腹腔内给药,自病毒感染当天开始,连续用药6天,发现治疗组比对照组存活时间延长1.5-3天,进一步的研究正在进行中。

  (三)灵长类和树鼩

  灵长类的研究尚无肯定的结果。

  非洲绿猴、脑内接种HFRSV后,观察7周,未见临床症状及病理变化。Amyx等发现猕猴和黑猩猩接种后,可有规律地出现短暂蛋白尿、病毒血症,偶见痰质血症。在日本,用HFRS病毒接种幼龄猕猴(Cynomolgus)后7周,可见有与HFRS病人相似的病理变化:肾、肺、脾、心脏和肝可见毛细血管扩张、部分脏器可见弥漫性血管内凝血(DIC)、肾髓质集合管退行性变、感染3-4周有蛋白尿,并在组织中检出抗原,但未观察到临床症状。看来猕猴可能有希望做为较好的致病研究模型。

  国内未志勇等将R3株病毒接种三只恒河猴(3~4岁),研究HFRS病毒在猴体内的分布、增殖和排出,研究结果表明,接种病毒后3~5天即出现病毒血症,直至血液中检出抗体前2天止,持续8天之久;猴产生抗HFRS抗体时间在接种后第14天,且IgG和IgM抗体同时出现;病毒血症期直至产生抗体上,猴体内各器官组织未发现病毒增殖。此时粪便和尿都未分离出HFRS病毒。从而可推测HFRS病毒在猴体内增殖的部位可能是循环血细胞内,这与近年来证明该病毒在病人血细胞内增殖相符。

  最近严玉辰等将A16株病毒接种于六只树鼩,每只由皮下和脑内混合接种10-1病毒悬液1ml。结果:1~2号树鼩于接种后7天死亡,经检测脏器抗原皆阴性,死后查血清抗体阳性。3~6号树鼩接种病毒后,经2~4次尿抗体检查均阴性,血清抗体皆阳性。接种病毒7天后,均有不同程度的体温增高现象。其中5号树鼩于接种病毒在9天死亡。抗原在树鼩脏器组织中的分布颇为广泛,但1~2号小兽血中有抗体,脏器内未检出抗原,何种原因尚待研究。初步看来此种小兽对HFRS病毒较敏感,但非理想的敏感动物。其不同年龄、不同毒株、不同剂量的实验,有待进一步深入研究。(本节常见病毒敏感动物的选择资料由王晶翼同志提供)。