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  二、信号转导中第二信使含量的测定

  信号转导过程中,第二信使(second messenger)含量的高低同信号传递密切相关。目前测定的第二信使主要包括细胞内Ca2+([Ca2+]i)、二酰基甘油(DAG)、三磷酸肌醇(IP3)以及环腺苷酸(cAMP)等。

  1.[Ca2+]i的测定 细胞内Ca2+的测定方法有原子吸收光谱法、离子微电极测定法、放射示踪法及标记示踪法等。目前常用标记示踪法,即用荧光探针标记靶细胞。常用的荧光探针有quin-2/Am、Fura-2/Am及Indo-1等。Fura-2/Am和Indo-1较为敏感。

  2.IP3的测定 采用3H-TdR标记的肌醇标记靶细胞后,用不同的刺激剂刺激细胞,分离磷脂酰肌醇混合物,通过阴离子交换层析柱(Serva公司Dowex1*8)分离洗脱,收集IP3洗脱峰后进行液闪测定。此外,还可以使用Amersham公司生产的D-myo-IP3[3H]分析系统直接测定粗提物中的IP3含量,此方法简易、敏感。

  3.DAG的测定 首先提取含DAG的样品,然后采用Amersham公司生产的DAG分析系统进行测定。此系统测定的原理是用DAG激酶催化底物DAG,使之发生磷酸化,外源加入32γ-ATP,最后将反应产物进行分离后测定放射性含量,根据标准品计算出样品中DAG的含量。

  4.cAMP的测定 可选择不同的方法:(1)cAMP[3H]分析系统,其优点是放射性半衰期长,可用于大量样品的分析;(2)cAMP[125I]分析系统,用于小量样品的分析;(3)cAMp ILISA测定方法,此方法简便、敏感。