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第三节 PCR操作范例及反应体系的组成

  一、PCR操作范例

  在一个典型的PCR反应体系中需加入:适宜的缓冲液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐热性多聚酶、Mg2+和两个合成的DNA引物。模板DNa 94℃变性1min,引物与模板40~60℃退火1min,72℃延伸2min。在首次循环前模板预变性3~5min;在末次循环后,样品仍需继续延伸3~5min以上,确保扩增的DNA为双链DNA。为便于了解PCR反应中各成份的组成,加入量和反应条件,使人们以此为基础,对不同的研究对象逐项改变来找到最佳反应条件,特列举Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA试剂盒提供的典型反应条件供参考。

表22-1 PCR反应混合液

成分 加入体积(μl) 最终浓度
双蒸馏水 53.5  
10×反应缓冲液[1] 10.0 [1×]Mg2+1.5mmol/l K+50mmol/L
4×dNTPs(各1.25mmol/L) 16.0 各200μmol/L
λ-DNA模板(全长48.5kD) 10.0 1ng/次
引物1,2(各25bp,20μmol/L)[3,4] 5.0 1.0μmol/L(100pmol)
Taq聚合酶储存液[2] 0.5 2U/100μl
总体积(pH8.3) 100.0  
石蜡油 50~100.0  

  扩增条件:94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25~30个循环。

  注:[1]反应缓冲液[10×]含:100mmol/l Tris-HCl pH8.3(25℃),

  15mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2,

  0.01%(W/V)明胶(Sigma G2500)

  [2]酶储存缓冲液(-20℃)含:50%甘油,100mmol/l KCl,

  20mmol/L Tris-HCl ph8.0

  0.1mmol/L EDTA, 1.0mmol/L DTT

  200μg/ml明胶

  0.5%吐温20,0.5% Nonidet P40

  [3][4]引物,1,2:扩增λ-噬菌体基因中500bp的片段

  引物1序列:7131~7155(5’)-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’)

  引物2序列:7606~7630(5’)-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’)

  注意(3’)端有2个bp互补故易生成50bp的双体

  二、PCR反应系统的组成

  (一)PCR缓冲液(PCr Buffer)

  用于PCR的标准缓冲液见PCR操作范例。于72℃时,反应体系的pH值将下降1个单位,接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要,影响PCR的特异性和产量。实验表明,Mg2+优于Mn2+,而Ca2+无任何作用。

  1.Mg2+浓度Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L(当各种dNTP浓度为200mmol/L时),但并非对任何一种模板与引物的结合都是最佳的。首次使用靶序列和引物结合时,都要把Mg2+浓度调到最佳,其浓度变化范围为1~10mmol/L。Mg2+过量易生成非特异性扩增产物,Mg2+不足易使产量降低。

  样品中存在的较高浓度的螯合剂如EDTA或高浓度带负电荷的离子基团如磷酸根,会与Mg2+结合而降低Mg2+有效浓度。因此,用作模板的DNA应溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。

  dNTP含有磷酸根,其浓度变化将影响Mg2+的有效浓度。标准反应体系中4×dTNPs的总浓度为0.8mmol/L,低于1.5mmol/L的Mg2+浓度。因此,在高浓度DNA及dNTP条件时,必须相应调整Mg2+的浓度。

  2.Tris -HCl缓冲液在PCR中使用10~50mmol/L的Tris –HCl缓冲液,很少使用其他类型的缓冲液。Tris缓冲液是一种双极化的离子缓冲液,pKa为8.3(20℃),△pKa为0.021/℃。因此,20mmol/l Tris pH8.3(20℃)时,在典型的热循环条件下,真正的pH值在7.8~6.8之间。

  3.KCl浓度K+浓度在50mmol/L 时能促进引物退火。但现在的研究表明,NaCl浓度在50mmol/L时,KCl浓度高于50mmol/L将会抑制Taq酶的活性,少加或不加KCl对PCR结果没有太大影响。

  4.明胶明胶和BSA或非离子型去垢剂具有稳定酶的作用。一般用量为100μg/ml,但现在的研究表明,加或不加都能得到良好和PCR结果,影响不大。

  5.二甲基亚砜(DMSO)  在使用Klenow片段进行PCR时DMSO是有用的;加入10%DM-SO有利于减少DNA的二级结构,使(G+C)%含量高的模板易于完全变性,在反应体系中加入DMSO使PCR产物直接测序更易进行,但超过10%时会抑制Taq DNA聚合酶的活性,因此,大多数并不使用DMSO。

  (二)四种脱氧三磷酸核苷酸(4×dNTPs)

  在PCR反体系中dNTP终浓度高于50mmol/L会抑制Taq酶的活性,使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入,高浓度dNTPs易产生错误掺入,而浓度太低,势必降低反应物的产量。PCR常用的浓度为50~200μmol/L,不能低于10~15μmol/L。四种dNTP的浓度应相同,其中任何一种浓度偏高或偏低,都会诱导聚合酶的错误掺入,降低合成速度,过早终止反应。

  决定最低dNTP浓度的因素是靶序列DNA的长度和组成,例如,在100μl反应体系中,4×dNTPs浓度若用20μmol/L,基本满足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列。50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μg DNA,而200μmol/L足以合成25μg/DNA。

  购自厂商的dNTP溶液一般均未调pH,应用1mol/l NaOH将dNTP贮存液pH调至7.0,以保证反应的pH值不低于7.1。市购的游离核苷酸冻干粉,溶解后要用NaOH中和,再用紫外分光光度计定量。

  (三)引物的量

  引物在PCR反应中的浓度一般在0.1~1μmol/L之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异,但浓度过低,不足以完成30个循环的扩增反应,则会降低PCR的产率。

  (四)Taq DNA聚合酶的量

  典型PCR反应混合物中,所用酶浓度为2.5U/μl,常用范围为1~4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同,以及其它条件的差异,多聚酶的用量亦有差异,酶量过多会导致非特异产物的增加。

  由于生产厂家所用兵配方、制造条件以及活性定义不同,不同厂商供应的Taq DNA聚合酶性能也有所不同。

  Cetus公司酶定义是:1个酶单位是指在以下分析条件下,于74℃,30min内使10nmmol的dNTP掺入酸不溶性成分所需的酶。测定时间为10min,折算成30min掺入量。

  分析条件为25nmol/L TAPS(三羟基-甲基-氨基丙烷磺酸钠pH9.3,25℃),50mmol/l KCl, 2mmol/L MgCl2,1mmol/L β-ME(巯基乙醇),dATP、dTTP、dGTP各200mmol/L,dCTP为100mmol/L(由不标记及α-32P标记混合),12.μg变性鲱鱼精子DNA,最终体积50μl。

  (五)模板

  单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA,须先通过逆转录得到第一条cDNA。虽然PCR可以仅用极微量的样品,甚至是来自单一细胞的DNA,但为了保证反应的特异性,还应用ng级的克隆DNA,μg水平的单拷贝染色体DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料,模板可以是粗品,但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白。

  DNA的大小并不是关键的因素,但当使用极高分子量的DNA(如基因组的DNA时),如用超声处理或用切点罕见的限制酶(如Sal1和Not1)先行消化,则扩增效果更好。闭环靶序列DNA的扩增效率略低于线状DNA,因此,用质粒作反应模板时最好先将其线状化。

  模板靶序列的浓度因情况而异,往往非实验人员所控制,实验可按已知靶序列量逆减的方式(1ng,0.1ng,0.001ng等),设置一组对照反应,以检测扩增反应的灵敏度是否符合要求。

  (六)石蜡油

  PCR扩增时建议在混合物上面铺一层石蜡油,减少PCR过程中尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失。研究表明,应用石蜡油可使扩增产量增加5倍,可能与石蜡油维持热恒定和整个反应体系中盐浓度有关。

  三、电泳分析

  在实际工作中常采用琼脂糖凝胶电泳。一般情况下先在电泳缓冲液或凝胶中加1%溴化乙锭(EB)(每100ml加100μl),然后将已经制备好的1%~2%琼脂糖凝胶(用电泳缓冲液配制)放入电泳槽内,加入待测样品10μl,同时用分子量标准品作标记。琼脂糖浓度应按分离DNA片段的大小进行选择,一般用1.5%~2%,电泳电压75V,待样品进行凝胶内距胶末端1cm时,切断电源,取出凝胶在紫外灯下直接观察结果。

  由于溴化乙锭可与双链DNA形成结合物,在紫外灯下能发射荧光,使EB的荧光强度增强80~100倍,所以,电泳后凝胶在紫外灯下可直接观察。一般肉眼观察DNA量可达10ng,其荧光强度与DNA含量成正比。

  DNA分子在凝胶中泳动速度决定于电荷效应及分子效应。前者由所带净电荷量决定,而后者与分子大小及构型有关。按照DNA分子大小,其凝胶浓度可做不同的调整。有条件的实验室也可用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析扩增的DNA片段。

表22-2 电泳检测扩增结果,EB荧光显色(254nm)

琼脂糖(%) kb PAGR(%) bp
0.3 60~5 3.5 100~1000
0.6 20~1    
0.7 10~0.8 5.0 80~500
0.9 7~0.5 8.0 60~400
1.2 6~0.4 12.0 40~200
1.5 4~0.2 20.0 10~100