仙一网 - 文献资料 - 医学书籍 - 实用免疫细胞与核酸

第二节 核酸(基因)探针目的核酸的制备技术

  一、特异性目的核酸(或基因)的制备

  核酸分子探针的制备首先需要获得所要的特异性核酸或其片段。可用以下方法制备:

  (1)直接分离基因核酸:即从基因组上直接用内切酶切下所需基因。

  (2)化学合成基因核酸:即以单核苷酸为原料,以固相磷酸三酯法合成某一结构完全清楚,分子量较小的寡核苷核。

  (3)酶促合成核酸:在真核细胞中获得特异的结构基因。常用方法是以mRNA为模板,利用逆转录酶合成单链cDNA,再以大肠杆菌DNA聚合酶I合成双链的结构基因。

  (4)RNA探针。

  二、目的核酸的扩增

  在获得特异的目的基因后,可用以下方法大量扩增制备:①用体外DNA重组技术与载体DNA相连,转化至大肠杆菌中进行无性繁殖。以氯化铯超速离心纯化重组质粒DNA,并以合适限制性内切酶消化,经凝胶电泳制备回收特异的目的核酸片段。②聚合酶链式反应(Poly-merase chain reaction, PCR)扩增技术:利用这种先进技术能简便快速制备大量特异性目的核酸片段。PCR技术的基本原理是利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特征,在体外用一对和欲扩增DNA片段的两侧序列互补的引物诱发聚合反应,即双链DNA先高温变性,然后在低温下与引物退火,再在中等温度进行链延伸反应。上述在三种不同温度下的变性、退火和延伸为一个循环反应,重复这种循环反应可使DNA获得指数性倍增,例如经过35个循环反应,DNA可扩增1×108倍以上。