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第一节 在细菌学中的应用

  免疫细胞化学在细菌学中主要用于菌种鉴定和抗原结构的研究。细胞都各自有其特异性抗原,应用特异性抗体的荧光素或酶标记物,可以鉴定任何一种细菌。已经成功地用于鉴定几乎所有致病菌的纯培养。尤其是应用免疫荧光技术具有较其他血清学方法简便、快速和敏感等优点,并能直接进行细菌形态观察。可用于鉴定的材料也比较多样,如培养物、感染组织、病人分泌排泄物,外环境中采集材料(土壤、水、杂物等)。由于此法对某些传染病原能较常规方法作出更快速的诊断,因而具有特殊意义。

  免疫细胞化学方法用于研究细菌抗原结构和形态学观察,由于单克隆抗体的应用,比其他方法更为有效。

图16-1 免疫荧光在病原细菌诊断程序中的应用时机

  从患者咽部粘膜用棉拭子取标本,作涂片用甲组溶血性链球菌荧光抗体染色,能够很快作出诊断。对于痢疾杆菌、霍乱孤菌、布氏杆菌、炭疽杆菌和脑膜炎双球菌、肺炎双球菌等的实验诊断均有较好的效果(如表16-1)。

  利用间接免疫荧光或酶标记抗体法,检测患者血清中的抗体更有价值,广泛用于临床诊断和流行病学研究。

表16-1 免疫荧光细胞化学方法在细菌诊断中的应用评价

菌种 疾病 标本 方法 敏感性 特异性 意义
甲组链球菌 急性咽峡炎

  猩红热

咽部培养物 DIF 诊断
  急性风湿热          
乙组链球菌 新生儿败血症 阴道拭子 DIF 快速
  脑膜炎 临床标本       鉴定
  牛型乳腺炎 培养物        
致病性大肠杆菌 婴儿腹泻 大便 DIF 过筛
杆菌            
伤寒沙门氏菌 肠伤寒 大便 DIF 诊断
沙门氏菌 肠炎 大便 DIF 诊断
(大多数血清型) 肠热脑膜炎 食品       过筛
    环境标本        
    培养物        
志贺氏菌属            
宋内氏菌 菌痢 大便 DIF 快诊
福氏菌 菌痢 大便 DIF 快诊
百日咳杆菌 百日咳 鼻咽涂片 DIF 快诊
流感嗜血杆菌 细菌性脑膜炎 脑脊髓 DIF 快诊
肺炎球菌 细菌性脑膜炎 脑脊髓 DIF 快诊
脑膜炎球菌 细菌性脑膜炎 脑脊髓 DIF 快诊
    出血点   (差)    
军团菌病 小叶肺炎 痰,肺渗出物 DIF 诊断
    肺组织切片 IIF     快诊
李氏菌 李氏单核细胞 体液涂片 DIF 诊断
  增多症 组织切片        
布氏杆菌 布氏症 胎盘 DIF 诊断
(牛、羊、猪型) (人、畜) 病理组织培养物 DIF 诊断
结核杆菌 结核病 痰及其消化液 DIF 诊断
胎儿孤菌 孤菌病 子宫阴道粘液 DIF 诊断
类丹毒菌 动物感染 血液、组织、培养物 DIF 较高 诊断
放线菌 放线菌病 扁桃腺病理排泄物 DIF 诊断
钩端螺旋体 钩体病 尿沉渣,新鲜组织刮片或切片培养物 DIF 诊断
奈瑟氏淋球菌 淋病 结膜、皮肤破损,关节 液 DIF 较高 过筛
绿脓杆菌 肺炎 病理组织 DIF 较高 诊断
类鼻疽杆菌 类鼻疽 排泄物 DIF 诊断
    病理组织 DIF 诊断
马疽杆菌 鼻疽 排泄物 DIF 早诊
    病理组织        
脆弱类杆菌 败血症 血及其他有关临床标本 DIF 较高 诊断
黑色素源标菌 牙周病物 病变部位分泌物 DIF 辅诊
  脏器脓肿          
梭状芽胞杆 肉毒中毒 食物 DIF      
菌属 动物黑腿病          
  变部组织          
  羊炭疽 大便等 DIF 较高 辅诊或诊断
  气性坏疽          
  破伤风          
  结肠炎等          
沙眼衣原体 沙眼 结膜刮片 DIF 诊断

  (引自,黄策:免疫荧光和荧光免疫。1983)

  一、甲组溶血性链球菌的快速检查法

  (一)试剂制备

  用抗甲组溶血性链球菌的抗体,以FITC标记,制成荧光抗体,再用C和G链球菌充分吸收;或用抗I型链球菌M蛋白成分的血清,标记后吸收,都有可靠的特异性。

  (二)检查方法

  (1)以棉拭子擦拭患者咽部粘膜,取标本。

  (2)将拭子浸入1ml肉汤小试管内,37℃培养2~3h。

  (3)取出棉拭了作分离培养,常规鉴定。将肉汤液离心3~4min,3000r/min,弃上清,沉淀加0.01mol/l Ph7.2 PBS 洗涤,再离心沉淀,弃上清。

  (4)以沉淀涂片,直径约1cm,涂两个圆形区。

  (5)将标本放入95%酒精中固定1min,然后浸入PBS中洗1次,取出室温晾干。

  (6)直接法染色,左侧标本作对照,加非溶血性链球菌荧光抗体染色。右侧加甲组溶血性链球菌荧光抗体染色。置湿盒中孵育20~30min,再用PBS洗2次,每次5min,振动洗涤,滤纸吸干标本周围的水。

  (7)加缓冲甘油封裱,立即荧光显微镜观察。

  免疫荧光检出的阳性率较培养法为高,因为前者可以检出抗菌素治疗后的死菌。二者符合率达95%。

  二、脑膜炎双球菌的快速检查法

  (一)制备荧光抗体

  可用多价和I、II、III、IV型单价的脑膜炎球菌抗血清,分别制备多价和单价荧光抗体。

  (二)检查方法

  用患者咽拭子,脑脊液或培养标本制备涂片,晾干,火焰或乙醇固定,37中染色30min,荧光显微镜检查。

  抗脑膜炎双球菌的荧光抗体有很高的特异性,可以快速检出和鉴定脑膜炎双球菌。有人应用免疫荧光检查267例脑膜炎病人脑脊液中脑膜炎双球菌,阳性率73.4%,培养和普通染色则只分别为41.9%和34.4%。

  三、霍乱弧菌和副霍乱弧菌的快速检查法

  霍乱和副霍乱是严重的传染病,快速诊断才能及早防治。取病人粪便标本直接涂片荧光抗体染色检查,与常规培养法比较,具有快速特异和检出率很高的优点。尤其适用于急性期病人的诊断。

  四、鼠疫杆菌的快速检查法

  鼠疫是烈性传染病,快速及时的诊断对于控制流行和救治病人有决定性意义,免疫荧光快速诊断方法是一种特异和敏感的手段。直接法和间接都可应用,以直接法更简便。

  五、炭疽杆菌的快速检查法

  炭疽也是一种烈性传染病,早期快速诊断对救治病人有决定性意义。免疫荧光检查方法对炭疽杆菌的检出率很高。应用抗夹膜荧光抗体检查炭疽杆菌有十分确定的诊断意义。也可用间接法检测血清中抗夹膜抗体。

  六、致病性大肠杆菌的快速检查法

  (1)制备当地常见的致病性大肠杆菌荧光抗体。

  (2)取病人大便标本或直肠拭子以生理盐水搅和涂片,晾干,火焰固定。

  (3)直接法免疫荧光染色,立即荧光显微镜检查。

  由于本菌较其他非致病性大肠杆菌组有特殊的抗原,不易发生强交叉反应。所以,在儿童肠炎和引起人群暴发性肠炎时更准确、快速和简便。

  七、结核杆菌的快速诊断方法

  结核杆菌感染机体后可以诱导产生抗体,可用间接法检查血、胸腹水和脑脊液中的抗体。

  也可用抗结核杆菌的荧光抗体直接法检查抗原。

  八、其他细菌的快速检查方法

  对军团杆菌、布氏杆菌、土拉杆菌、产气夹膜杆菌等的快速诊断,效果良好。

  九、钩端螺旋体的检查法

  (1)根据当地钩端螺旋体的型别制备多价抗体、标记FITC制成荧光抗体。

  (2)检查方法:

  ①血液标本的检查:取发热期的病人或发病动物的血液约2ml,制取血浆,并加入钾明矾(0.058g/ml),振荡混匀后置室温10~15min,然后中速离心沉淀,取沉渣涂片,晾干,95%酒精固定。免疫荧光染色,镜检。

  ②尿液标本检查:取病人或动物尿液约2~3ml,高速离心,取沉渣涂片,无水乙醇固定,免疫荧光染色,镜检。

  ③脏器标本的检查:取发病动物的肾脏皮质部分,以刀片切出整齐断面,滤纸吸去血液,再以洁净载玻片压印制片,晾干后以丙酮在4℃固定。经10%甲醛固定的组织可作冰冻切片,依丙酮-乙醇-甲醇的次序固定,荧光抗体染色前以3%表面活性剂如Tween20处理切片,据称,这样可使荧光强度增加4倍。

  ④培养液检查:同尿处理。

  ⑤特异性抗体的检查:用适当血清型的钩端螺旋体作抗原,用间接法检查病人血清中的特异性抗体,可用于流行病学调查和临床追溯诊断。此检查适用于人类和家畜等。

  本法诊断钩端螺旋体,一般只具有属的特异性,鉴定抗体则可能达到型的特异性。

  十、梅毒螺旋体的检查法

  免疫荧光细胞化学应用于梅毒血清学诊断有很多文献报道。70年代应用PAP法又将敏感性提高了许多倍,此法已作为梅毒诊断的常规方法。用间接免疫荧光法可PAP法,取已知梅毒螺旋体作抗原,检查病人血清中的特异性抗体。

  (一)抗原制备

  以标准株(如Nicol株)梅毒螺旋体感染家兔睾丸,约1周后待睾丸产生明显炎症,剖腹将睾丸摘除,仔细清除精索、附睾和包膜,然后以灭菌器械将其剪成薄片,置于烧瓶内,加入20ml生理盐水,振荡30min,使螺旋体逸出,2000r/min离心10min以除去组织碎块和血细胞,将上清高速离心(10,000r/min)30min,去上清,沉淀以5ml生理盐水洗涤,再高速离心,洗涤,反复3次以上,以尽可能除去组织成分和家兔球蛋白,最后以pH7.2PBS(内含0.01%硫柳汞或数滴福尔马林以防腐)将沉淀制成敏感毫升约含10,000,000螺旋体的悬液,置4℃保存备用。有效期约半年。

  (二)荧光抗体

  用抗人IgG和IgM荧光抗体。为诊断新生儿先天性梅毒,必须用抗人IgM荧光抗体。

  所有稀释用PBS 0.1mol/L Na2HPO4-KH2PO4,0.15mol/l NaCl Ph7.2含1%Tween-80。

  (三)间接免疫荧光染色方法(FIA试验)

  1.定性检查  先将待检血清灭活。在载玻片上以白金耳取抗原液涂片,每片涂4个点,在室温中晾干,丙酮固定10min。各点分别加-1:50稀释待检血清;②-1:200稀释阳性血清;③-1:50稀释阴性血清;④-PBS。放入湿盒,在37或室温中放置20min,用PBS振荡洗涤10min,再加适当稀释的抗人IgG和IgM荧光抗体,再同上条件下放置20min,水洗,封裱,镜检。结果如①、②荧光阳性,③、④阴性,待检血清即判断为阳性。阳性时梅毒螺旋体呈明亮的黄绿色荧光,亦有人将待检血清稀释1:200作定性检查,这样可排除低稀释时正常人可出现的假阳性反应,此法又称FTA-200试验。

  2.滴度测定  如定性检查阳性,则被检血清应进一步稀释成1:100,1:200,1:400,1:800,1:1600……以定出染色滴度,滴度疑点以螺旋体发“++”荧光为标准。

  (四)荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验(Fluorescent treponemal antibody – absorption Test 简称FTA-ABS)

  FTA-200试验敏感性较差,有时查不出潜伏期和晚期梅毒。FTA-ABC试验不但敏感性高,而且特异性更好。方法是将非致病性螺旋体Reiter株的培养液于121℃高压加热10min,然后高速离心、沉淀,取其上清浸液作为吸附剂,并用以稀释病人血清(1:5),然后如上法(FTA试验)进行染色检查。

  FTA-ABC所用的反复洗涤过的纯梅毒螺旋体抗原,推荐置1.0%清蛋白、0.0375mol/l 葡萄糖、0.01mol/L二氯化镁和0.85%氯化钠溶液(用0.1mol/L磷酸钾缓冲液pH6.8配制)中冰冻干燥保存,其中清蛋白起保护剂的作用,葡萄糖可增加折光率,二氯化镁维持螺旋体的形态学,缓冲液稳定pH。

  (五)梅毒螺旋体的直接检查法

  取梅毒局部硬结渗出液涂片,用直接法或间接法免疫细胞化学染色,更容易发现隐藏在细胞碎片之间的螺旋体。免疫荧光检出效果和暗视野检一样敏感。如用RB200标记牛清蛋白作初染色,图像更为清晰。