第二节　在研究和诊断自身免疫性疾病中的应用

　　在自身免疫性疾病的诊断中，目前常常用免疫细胞化学技术检查相应的自身抗体作为重要诊断依据之一，并以此探讨自身免疫性疾病发生的免疫机理。

　　用免疫荧光法可以检查的自身抗体日益增多，具有器官特异性的自身抗体如甲状腺球蛋白抗体和甲状腺微粒体抗体，甲状腺第二胶质抗体，肾上腺抗体，胃壁细胞抗体，皮肤表皮间粘合质（Intercellular Cement of epidermis）抗体和基底细胞层抗体，唾液腺导管细胞抗体，胰岛细胞抗体，肾小球基底膜抗体，结肠粘膜上皮多糖物质抗体，精子抗体，卵巢抗体，胃G细胞抗体等。

　　用免疫荧光法可以检查出的非器官特异性自身抗体，有抗核抗体，平滑肌抗体，线粒体抗体、横纹肌抗体、神经髓鞘（外周）抗体、抗网状纤维抗体等。

　　还有报告用免疫荧光法检查血细胞自身抗体如抗白细胞（淋巴细胞）、红细胞，血小板抗体等。

　　一、抗核抗体（Antinuclear antibodies, ANA）的检测

　　Friou等（1957）首先用免疫荧光法检查出存在于SLE病人血清中的NAN，Alexander和Duthie（1958）证实了Friou等的结果。Friou等（1958）检查了28例SLE病人血清中有27例ANA阳性。一例阴性属临床长期不活动性病人。以后大量报告都指出用免疫荧光间接法检查ANA对于临床诊断SLE有重要价值，其阳性率在80%～100%之间，阳性对于SLE病有确诊价值，但阴性不能完全排除SLE，因为少数活动性SLE其ANA可能维持阴性，Fessel氏认为可能是一种亚型。正常人0%～4%，类风湿关节　炎、皮肌炎、硬皮病、sjogeren’s综合征，混合性结缔组织病、慢性活动性肝炎等多种疾病也呈不同程度的ANA阳性率，ANA可能是一种自身免疫反应的一个重要指标。ANA在各种疾病中的百分率见表15-1。

表15-1 抗核抗体在各种疾病中的百分率

　　Hargraves对狼疮细胞（1948）已进行了大量的研究，证明引起狼疮细胞发生的因子，为抗核成分的抗体。抗核抗体是一组对细胞核内DNA，RNA或组蛋白、或这些物质的分子复合物的自身抗体，目前发现至少有十七种。这些抗核抗体对于结缔组织病的致病病因的探讨和临床诊断均有重要帮助。这些结缔组织病各有不同的抗核抗体谱（Antinuclear Antibodies profile）。

　　目前，国内已建立了11种测定方法，提高了结缔组织病的诊断水平。

　　用作检查ANA的抗原很多，如鸡的红细胞核，人白细胞，皮肤，甲状腺、脾脏、淋巴瘤、胸腺、肾、羊膜细胞、颊细胞等，还有Hela细胞，大小白鼠的肝和肾冰冻切片（4～6μm）等，以成年小白鼠的肝切片最为常用。用动物细胞核作抗原，可以避免血型的干扰因素。Konice氏等（1978）报告用马疫锥虫（Trypanosoma equiperdum, TE）作抗原测定SLE病人血清中抗双链DNa （dsDNA）因TE的核和动基体为不含蛋白的纯dsDNA，抗原性纯一，特异性强，不需提纯，为天然的dsDNA底物，据认为抗dsDNA抗体为SLE所特有，一些研究指出dsDNA抗体与SLE病情活动及狼疮肾炎的发病机理有密切关系，持续高滴度的抗dsDNA抗体是狼疮肾炎的不祥之兆。

　　1．抗核抗体的荧光形态及临床意义ANA的荧光形态和其相应抗原有密切关系，ANA的抗原性质和自身免疫性疾病有关，所以，观察荧光形态与临床诊断可能有一定联系。

　　（1）周边型（或称核周型）：可见荧光以核边缘强，核轮鲜明，靠核膜的荧光呈绒毛状，核中心荧光弱或无。这是天然DNA或去氧核糖蛋白的抗体产生的一种荧光形态，肝细胞核，肾小管上皮细胞核和鸡红细胞核较典型。常见于活动性系统性红斑狼疮病人血清中。药物引起的狼疮样综合征也常出现。这些病人病情严重，肾受累的约占56%，与疾病进行性发展和狼疮细胞现象密切相关。

　　（2）均质型（或称弥散型）：可见全核呈均匀一致的黄绿色荧光，核轮廓明确。血清中这种抗体用脱氧核糖蛋白吸收可以消除。证明是由核蛋白抗体（主要是IgG类）与核中脱氧核糖蛋白反应的结果。此种荧光形态常见于活动性系统性红斑狼疮病人，偶见于恶性病或结缔组织病。滴度多在1：160以上。如将血清适当稀释即可出现其它染色形态，证明其中尚有其他荧光形态的抗体混在其中。弱阳性均质型意义不明，供血员有3%～10%的阳性。

　　（3）斑点型（或称小结型）：核轮廓不鲜明，核内呈斑点状荧光。由核内Sm抗原引起的一种抗体，包括IgG、IgM或IgA三类抗体。当用原血清染色时，斑点呈大团块状，稀释血清时变为分散的斑点状。主要见于硬皮病及肢端动脉痉挛病（雷诺氏病），也见于系统性红斑狼疮。

　　（4）核仁型：仅是核仁呈现黄绿色荧光，血清中此类抗体较少见。用肝细胞核和培养细胞作抗原可以检查出来。因血片中粒细胞及正常淋巴细胞中缺乏核仁抗原，检查不出此抗体。此型抗体可有IgG、IgM或IgA类。最常见于系统性硬化症、硬皮病、皮肌炎和sjogren’s综合征，其他胶原病很少见。

　　其次，还可见核膜型、结节　样网状型等，没有明确的诊断意义。ANA的相应抗原和荧光类型见表15-2。

表15-2 ANA的相应抗原和荧光类型

　　2．ANA的滴度与病情的关系Tablonska等的研究认为活动期红斑狼疮ANA的滴度在1：160或更高，国内的报告滴度在≥1：80则显示病情的活动性，滴度高是系统性红斑狼疮诊断的依据之一，高滴度与病情活动性相平行。高俊达（1979）对于ANA滴度变化的临床意义研究指出，60例系统性红斑狼疮病人血清中ANA滴度的变化与病情活动性、脏器损害、预后和其他化验指标的关系如下：

　　（1）ANA滴度在1：80～160以上有80.5%属临床活动性，有89.5%～97.8%缓解期病人在1：160以下。

　　（2）ANA滴度变化与临床症状是一致关系，但先于疾病的活动而升高，后于症状的缓解而下降。

　　（3）ANA滴度变化与狼疮细胞、血沉、尿蛋白和血清γ球蛋白含量异常一致。

　　（4）ANA滴度可作强的松用量的选择参考，ANA滴度在1：160以上者要加紧积极治疗，1：40以下者可减至维持量。

　　ANA的免疫组织化学检查对于诊断没有皮肤损害的红斑狼疮病帮助更大，取病人的皮肤作冰冻切片，用ANa IgG荧光抗体直接法染色，可见在表皮与真皮连接处显示荧光带。Tuffanelli报告病人有皮肤损害，直接免疫荧光检查ANA的阳性率为90%，在正常皮肤中红斑狼疮病人ANA的阳性率可达56%，而后者在其他疾病极少见，因而有较大的诊断意义。

　　二、双链DNA抗体（Double strand DNA antibody, dsDNA）的检测方法和应用

　　目前的研究指出，用免疫细胞化学检查病人血清中的dsDNA抗体为作为系统性红斑狼疮的诊断依据之一。佐佐木毅等和徐世玉等发现一些临床症状和血清学检查不典型的红斑狼疮病人，在发病早期就出现抗dsDNA抗体，认为这可能有助于早期诊断。

　　1．用马疫锥虫抗原检测抗dsDNA抗体方法

　　（1）底物制备：用马疫锥虫感染小鼠2～4天后，取小鼠的外周血，按血液细胞计数法作马疫锥虫计数，达到4.3×10⁶～5.6×10⁶时即采尾血涂片，空气干燥后直接使用或4℃保存备用。

　　（2）方法和结果：血涂片加入少量水溶去红细胞，待干。加入一滴被检血清于其上，移湿盒中，在室温中30～40min，用0.01mol/l pH7.4PBS洗5～10min，取出吸干，加兔抗人IgG荧光抗体，在湿盒中染色30～45min，再按上法洗片，待干，荧光显微镜检查。阳性者可见锥虫的核及动基体发出明亮绿色荧光。

　　2．用短膜虫抗原检测抗dsDNA抗体方法

　　（1）底物制备：用北京生物制品研究所制备的短膜虫涂片标本作抗原。

　　（2）方法和结果：用上述马疫锥虫抗原的间接免疫荧光染色法。短膜虫是一种血鞭毛虫，动基体中含纯净的dsDNA可作为抗原，阳性结果可见虫体近尾或中部有一致密荧光亮点，为动基体，近头部有一淡绿色亮点，为细胞核。阴性结果动基体上无荧光。阳性血清自1：5稀释，测定效价。

　　3．用酸洗脱鼠肝细胞抗原检测抗dsDNA抗体方法（参考Ta的方法）

　　（1）底物准备：将6个月小白鼠剪断上腔静脉，立即用0.01mol/l pH7.4 的PBS从门静脉灌洗至鼠肝发白，取出肝组织剪成接触面为0.15cm×0.5cm的小块，印片，空气中干燥后用丙酮固定10min，再空气干燥。浸入0.1mol/l HCl中洗脱30min，并轻轻的摇动，随后，再用0.15mol/l PBS pH7.4洗2次，每次10min，再用0.01mol/l pH7.6的PBS洗5min，空气干燥。即可用或在4^℃中贮存。

　　（2）方法和结果：用间接免疫荧光法检测，阳性结果可见细胞核呈黄绿色荧光。用酸洗脱鼠肝细胞标本作抗原与马疫锥虫、短膜虫法比较结果，和马疫锥虫法符合率达93%，其中马疫锥虫法4例阳性，为系统性硬皮病，而此法为阴性，说明此法较马疫锥虫法更特异。此法与短膜虫法比较，符合率为95%，P>0.05，说明二法无显著差别。其中此法阳性而短膜虫法阴性的3例，均符合系统性红斑狼疮诊断，并均有肾损害。短膜虫法阳性而此法阴性的6例均为待查病例，不能证实为系统红斑狼疮诊断，说明此法在特异性方面更佳。

　　三、抗核仁抗体的检测法

　　用HEP-2细胞或大鼠肝细胞作抗原，作间接免疫荧光染色。结果可见细胞核核仁呈现明亮的黄绿色荧光。抗核仁抗体在硬皮病、皮肌炎、系统性硬化症等中最多见。

　　四、抗组蛋白抗体的检测方法

　　1．组蛋白的提取方法取大白鼠肝40g 加入160ml0.01mol/l Ph7.4 Tris HCl缓冲液，制成匀浆后进行浓度梯度离心（27000rpm×60min），沉淀物中加入蒸馏水90ml，再以超声粉碎仪将细胞打碎，离心（3000rpm×15min）取上清液，再加入一定量的1mol/l 硫酸，使硫酸的最终浓度为0.2mol/L,混匀后，离心（3000rpm×15min），取上清液，加入4～5倍体积的无水乙醇，置于-20^℃冰箱3天后，离心（3000rpm×15min）以乙醚洗涤沉淀，真空干燥，储存于-20℃冰箱中备用。

　　2．酸处理的鼠肾底物　 鼠肾冰冻切片（厚度4μm），以丙酮固定后吹干，密封，在-20^℃冰箱中储存备用。用前再于0.1mol/L盐酸中浸泡30min，然后再置于0.01mol/l pH7.4PBS中浸泡2次。

　　3．组蛋白重建的鼠肾底物在上述酸处理的鼠肾底物上加入30μl乙制备好的组蛋白，稀释浓度为25μl/ml，在室温中湿盒内孵育30min后，以0.01mol/l p7.4PBS浸2次。

　　4．检测方法用组蛋白重建的鼠肾底物，做间接免疫荧光测定。

　　5．结果1960年Kunkle首先在SLE中发现抗组蛋白抗体（Antihistone antibody ,AHA），是诊断药物性SLE的一项较好的指标。在活动期SLE中AHA可达90%。

　　五、抗着丝点抗体的检测方法

　　1．HEP-2细胞涂片的制备HEP-2细胞系人喉癌上皮细胞，在完全Eagle培养液中，37^℃，二氧化碳孵育48～72h，使细胞生长达到一定数量，约1.2～1.5×10⁶/ml，经胰酶消化后，可以传代或分装到置有玻片的培养皿中，继续用Eagle液培养及上述条件孵育，48h细胞不仅贴附于玻片上并已长成单细胞层。取出玻片用丙酮固定15min，自然干燥后待用，或保存于-20^℃或4℃中。

表15-3 各种抗核抗体及临床意义

　　注：Sm（Smith）；RNP：核糖核蛋白；Sn：为小核；SSB：干燥综合征B；SS-A：干燥综合征-A，Scl-70：硬皮病70，抗原分子量70000；PCNA：增殖细胞抗原；PM-1：多发性肌炎-；RANA：类风湿性关节　核抗原；dsDNA：双链DNA；ssDNA：单链DNA。

　　2．染色方法用间接免疫荧光法。

　　3．结果着丝点抗原是紧附于染色体着丝点的DNA蛋白质，当与相应抗体结合后荧光图型为约46个圆的荧光亮点。国际上多用HEP-2细胞，因这种细胞核大，分裂相旺盛，着丝点容易显露，这种抗体在进行性系统性硬化症（PSS）中阳性率可达31%～98%，是PSS的CREST型的标记抗体，CRESF是指具有软组织钙化，雷诺现象，食管功能低下，指端硬化，毛细血管扩张的PSS患者。

　　六、抗甲状腺自身抗体（Thyroid Autoantiodies）的检测方法

　　Roitt等（1956）和Witebsby等（1957）就发现桥本氏病人血清中有对甲状腺提取的抗体活性，后来White（1957）首次用间接免疫荧光染色方法研究桥本氏病人血清存在对甲状腺胶质（thyroid colloid）的抗体获得成功。此后，Landing等（1958）和Holbrow等（1959）以不固定的甲状腺切片作抗原。检查出慢性甲状腺炎（Chronie thyroiditis）病人血清中有和细胞浆结合而呈现明亮染色的抗体。Blizzard等（1960）,Doniach 等（1960）发现第二胶质抗体，血高γ球蛋白，沉淀素阴性，鞣酸细胞血凝试验阴性，抗甲状腺微粒体补体结合试验阴性。Balfoour等（1961）用免疫荧光法研究一些甲状腺病人时总结指出：甲状腺胶质抗体有三种不同的荧光形态：一种是呈三维状云絮状，是一种血清沉淀素阳性产生的抗甲状腺球蛋白抗体。另一种是胶质部分荧光呈裂纹形，胶质无明显阳性荧光，而胶质边缘和裂纹处呈明亮荧光，鞣酸化细胞血凝反应阳性，沉淀素反应阴性。第三种即上述的胶质呈均匀荧光形状，证实这是一种称第二胶质的抗体。近30多年的研究证明免疫荧光方法检查甲状腺自身抗体是一个特异、敏感、简便的方法，对于临床诊断和治疗，随访和预后，甲状腺某些疾病的自身免疫性质的发病机理研究等，都有一定的实用价值。我们20年大量研究结果也证明确实如此。用免疫荧光法检查甲状腺自身抗体已成为许多国家中，诊断甲状腺疾病的常规检查项目之一。

　　检查这种抗体的免疫荧光方法要求取正常人的甲状腺或手术摘出的甲状腺组织，用冰冻节　片（3～6μm）用作甲状腺球蛋白抗体检查切片需要经56^℃纯甲醇固定3min；用作甲状腺微粒体抗原切片无需固定处理，因固定会破坏微粒体的抗原性。按常规间接方法进行。

　　关于甲状腺抗体的研究已报告有甲状腺球蛋白抗体，微粒体抗体，第二胶质抗体，甲状腺刺激免疫球蛋白抗体，甲状腺激素T₄及T₃抗体，细胞表面的促甲状腺激素受体的抗体等。

表15-4 不同甲状腺疾病甲状腺自身抗体的阳性率（%）

　　七、平滑肌抗体（Smooth muscle antibody , SMA）的检测

　　Johnson（1965）首次用免疫荧光组织化学间接法在狼疮样肝炎病人血清中发现了SMA，用鼠胃滑肌作抗原。Whitingham用病人自身平滑肌作抗原，证实了SMA的自身免疫性。狼疮性肝炎或慢性活动性肝炎病人血清中SMA的阳性率可达80%以上。Donidht和Whitehouse先后报告了急生病毒性肝炎病人血清中SMA为IgM，而慢性活动性肝炎病人血清中SMA在发病初期（1～4期）为IgM，而后为IgG。Anderson利用纯化肌浆蛋白为抗原与肝炎病人血清中分离的IgM和IgM类SMA进行吸收试验，证明了SMA的特异性。Holborrow Gamel和Renbe先后观察了SMA与鼠肝细胞，肾小球及人的甲状腺上皮细胞和血小板等组织为抗原的免疫荧光染色结果，证明这些组织的抗原性均与平滑肌肌动蛋白有着共同性抗原。

　　现在多以大白鼠胃壁和肾组织血管壁平滑肌的4～6μm冰冻切片和抗原，附贴在干净的盖玻片上，电扇吹干，放入4^℃干燥剂中保存，用前可固定于95%（4^℃）酒精中1min，或不固定进行间接免疫荧光检测。

　　染色结果可见胃壁平滑肌，粘膜肌层和肌丝，小血管壁平滑肌等呈现出明亮的黄绿色荧光。有人用荧光检查急性期甲、乙二型肝炎暂时出现SMA的阳性率达80%，稀释血清应在1：10以上的确定为阳性，一般认为，肝细胞表面存在肌动蛋白样物质。慢性活动肝炎患者滴度在1：80以上，急性肝炎患者SMA属IgM类，滴度1：25以上，慢性迁延性肝炎患者SMA也常阳性，滴度1：25左右。使用皮质激素者SMA转阴或滴度降低。健康输血员用原血清或1：5稀释，常有9%～18%的低滴度SMA阳性，似无诊断意义，SMA与性别，年龄无关。

　　非肝病的SMA阳性者，主要见于传染性单核细胞增生症，类风湿性关节　炎，支原体感染疣，恶性肿瘤（如乳腺癌）。除传染性单核症滴度可达1：320外，一般常≤1:25，其血清与非肌性结构细胞不产生反应。

　　平滑肌抗体是抗肌球蛋白和肌纤维收缩蛋白的抗体，当肝细胞损害时，释放抗原引起的自身免疫反应。已证实慢性活动性肝炎病人血清中平滑肌抗体是具有特异性的血清学标志，但必须是高效价（1：80）以上，因在人群中常见低效价（1：10～1：20）。临床的研究指出，平滑肌抗体与生化指标改变程度相关，说明高效介平滑肌抗体与肝脏损害有关。Kurki等研究SMA在慢性活动性肝炎等的意义。

　　Middelton等报告检查了70例肾衰病人自身抗体，肾移植后3个月平滑肌抗体IgM类阳性率占76%，而移植前14%。SLE常是SMA呈阴性结果，可作鉴别诊断参考。

　　八、肝细胞膜抗体（Antibody to the hepatocyte membrane, HMA）的检测

　　Lee等用Rouin氏液固定的大白鼠肝切片作抗原，作间接免疫荧光（IIF）检查，在慢性活动性肝炎（CAH）病人血清中成功的发现了HMA，肝细胞膜呈现黄绿色荧光，12例CAH中11例HMA阳性（93%）10例原发性胆汁性肝硬化（PBC）全部阳性，20例胶元-血管疾病1例阳性（5%）7例非免疫肝病中1例阳性（14%），正常人22例中仅1例阳性（5%）。

　　Bouin氏液固定大白鼠肝冰冻切片和IIF检查HMA的方法很简便，特异，对于诊断CAH和PBC，研究病因是很有价值的。

　　免疫荧光方法：取Wistar大白鼠复合组织（胃窦、肾皮质和髓质和肝）用恒冷箱冷冻切片机作冰冻切片，4μm厚，贴于玻片上，在空气中干燥至少30min。在室温中用Bouin氏液（75ml饱和苦味酸溶液，24ml甲醛，19ml冰醋酸）固定10min。切片在pH7.40.01mol/L PBS中洗3次，15min，同时搅拌，切片在空气中干燥后立即应用，或存放在-20℃备用。作间接免疫荧光染色。

表15-5 平滑肌抗体在不同疾病中的百分率

　　九、线粒体抗体（Mitochondrial antibody, AMA）

　　用人肾（新鲜手术或尸检6h以内）采用肾皮质或大白鼠肾脏冰冻切片不需任何固定，作检查AMA抗体的抗原底物，间接免疫荧光结果可见远端肾小管上皮细胞浆呈现均匀的荧光。Walker等（1965）首先用此法在原发性胆汁性肝硬化，隐原性肝硬化和慢性活动性肝炎中发现AMA，以原发性胆汁性肝硬化（158例/188例）阳性率最高（84%），由于阻塞性肝胆疾病不产生这种抗体，可作鉴别诊断的指标。

　　这种抗体可以是IgG，IgM及IgA，无组织和器官特异性。

　　Klarskin等（1972），Walker等（1970，1972），对于这种抗体的临床应用进一步作了证实。AMA对疾病的发生的作用尚不明确，有人认为不起作用，有人则认为是造成肝细胞胆小管细胞进行性破坏的自身免疫过程的一个标志。而这两种细胞受累的程度将决定性地导致原发性胆汁性肝硬化。慢性活动性肝炎和隐原性肝硬化33例中阳性率为60%，233例门脉性肝硬化和332例病毒性肝炎中未查出AMA。Vandell等对106例B型萎缩性胃炎患者检查AMA全部阴性。我们很少见到AMA阳性的原发性胆汁性肝硬化病例。

表15-6 AMA亚类及其临床意义

　　由表15-6可以看出，AMA不同亚类所对应的抗原存在的差异，其病理意义也各不相同。原发性胆汁性肝硬化患者血清中主要检出抗M₂型AMA，抗原位于线粒体内膜。

　　十、胃壁细胞抗体（Gastric parietal cell antibodies, PCA）的检测

　　Taylor等（1962）和Iruine等（1962）同一年发现PCA，以恶性贫血病人血清中阳性率最高（90%～100%）。慢性萎缩性胃炎国外报告阳性率20%～60%，伴有恶性贫血者可达90%。其次，甲状腺疾病，糖尿病、肾上腺皮质机能减退及缺铁性贫血等疾病，常伴有PCA阳性。我国恶性贫血发病率低，PCA阳性率在15%～25%之间，正常人2%～5%，60岁以上可高些（16%）。Strickland等（1973）称PCA阳性萎缩性胃炎为A型胃炎，胃窦炎的发病率低，大部分为胃体广泛性萎缩病变，发展后果为恶性贫血。B型患者PCA阴性，胃窦炎的发病率高，胃体部仅有局限性萎缩病变。各种疾病PCA检出阳性率见表15-7。

表15-7 各种疾病PCA检出阳性率

　　Odger等（1968）发现恶性贫血病人胃粘膜内含IgA细胞减少到正常的10%，IgM细胞减至50%，而IgG细胞则增加至15%，后者选择性的出现在残余的壁细胞周围。Baur等（1968）用人胃粘膜匀浆中微粒体部分标记荧光素和9例恶性贫血病人胃粘膜切片反应，其中7例PCA阳性者的胃粘膜因有层见特异性吸附荧光的浆细胞，证实PCA是炎性浸润的浆细胞所产生。

　　十一、胃泌素细胞抗体（Gastrin Cell antibodies, GCA）的检测

　　慢性表浅性胃炎病人有33%血清中GCA阳性，慢性萎缩性胃炎病人也有32%阳性。提示慢性表浅性胃炎与慢性萎缩性胃炎可能是相同本质的病变，可能有着共同的自身免疫反应的背景和发病基础。

　　GCA的检查方法，杀死雄性小白鼠后立即取胃窦组织，固定于4%MFF液中3天（MFF液的配法：在60^℃的蒸馏水25ml中加入4g多聚甲醛，加4滴1N NaOH，再用NaOH或Na₂HPO₄调ph 至7.4后，再加入0.1mol/l PB Ph7.4 25ml）。组织脱水后，用56^℃石蜡包埋，切片3～5μm。56^℃烤干，脱蜡至水洗，取病人血清滴加在切片上，37℃45min，用常规间接免疫荧光法染色。荧光显微镜观察，可见G细胞浆呈黄绿色荧光，即是GCA阳性。

　　十二、胰岛细胞抗体（Islet cell antibady, ICAb）的检测

　　Bottazzzo（1974）用人胰腺，近年有人用兔胰腺的冰冻或石蜡切片抗原，间接免疫荧光法检测糖尿病人血清中有ICAb，发现约在60%～70%的新诊断的胰岛素依赖型糖尿病（IDDM）病人不论年龄大小，其ICAb均呈阳性。ICAb对胰岛四种细胞均起反应，一般是暂时性的。只有约20%或更少的ICAb阳性者可持续2～5年。而单纯饮食控制的非胰岛素依赖型糖尿病阳性率很低，和对照组相似（约0.05%）。在IDDM病人中，有85%的糖尿病人于症状发作后，立即出现ICAb，并随病程的持续而减少。Leudrum等（1976）报告用间接免疫荧光细胞化学发现ICAb在依赖胰岛素的糖尿病人中阳性率为38%（319/829）。而非依赖胰岛素的糖尿病人中阳性率只有1.7%（3/177）是ICAb阳性。

　　ICAb是针对胰岛细胞细胞质成份的抗体，或许是在症状发生之前，紧接着细胞损害而出现的。提示IDDM的发病可能具有自身免疫反应的免疫病理机理。

　　十三、抗肾小球和肺泡基底膜抗体的检测

　　免疫病理证明基底膜抗体是引起肺出血肾综合征即Goodpasture symdrome的主要病因。需要取病人的痛和肺穿刺活检组织，作冰冻切片，用直接免疫荧光细胞化学方法检测Igg ，IgM和C₃等在基底膜上沉着的情况。在肾小球和肺组织基底膜上呈线形荧光分布。在人急性肾小球肾炎中可见呈线形荧光，而膜性肾小球肾炎中，抗原抗体复合物沿肾小球基底膜呈结节　状沉积，藉以诊断和鉴别诊断。

　　1．抗原切片　　取病人肾穿刺或肺穿刺组织，作冰冻切片，厚4～6μm，不固定。肾切片应先在显微镜下选取有肾小球的用作免疫荧光染色。

　　2．直接法免疫荧光细胞化学染色方法分别用抗人IgG、IgA、IgM和补体C₃荧光抗体染色。同时作对照试验。

　　3．荧光显微镜检查肺出血肾综合征病人的肺泡基底膜，肾小球基底膜上都呈现明亮的线形荧光。主要是IgG类抗体，补体C₃荧光也呈线形，沿基底膜线形弥散分布。

　　十四、抗皮肤成分自身抗体的检测

　　抗皮肤成分的自身抗体在疱疹性皮肤病中具有诊断和鉴别诊断意义，寻常性天疱疮具有鳞状上皮细胞间隙抗体，类天疱疮具有基底膜带抗体。这种自身抗体无种属特异性。用直接免疫荧光法检测皮肤活检组织，间接法可用以检测病人血清中的抗皮肤成分抗体。

　　1．抗原切片直接法免疫荧光细胞化学检查，可以取病人皮肤活检组织作冰冻切片。

　　间接法检查常用大白鼠，豚鼠的食道上1/3部分作冰冻切片。也有人曾用猴、人、小白鼠和兔的食道上皮组织，人的正常皮肤，大白鼠、猴、豚鼠和兔唇和舌等作冰冻切片。认为人正常皮肤，小白鼠食道和大白鼠舌，可作为常用抗原，材料来源方便，经济，易推广应用。

　　2．免疫荧光细胞化学染色方法

　　（1）直接法：取病人皮肤活检组织一部分作常规石蜡切片，HE染色，作常规病理组织学诊断，一部分作冰冻切片的直接法免疫荧光染色。荧光抗体用抗人IgG、IgA、IgM和补体C₃分别染切片。同时作对照试验。

　　（2）间接法：用病人血清与食道等抗原切片反应后，分别用抗人IgG、IgA、IgM荧光抗体染色阳性结果，可以进一步作滴度检测。同时作对照试验。

　　3．荧光显微镜检查直接法检测结果可见疱疹性皮肤病中各有一定的荧光形态，可见免疫球蛋白的沉积。

　　刘荣卿等（1987）用直接免疫荧光组织化学方法，对临床拟诊为天疱疮或大疱性类天疱疮病例进行检查，活检取病变附“正常”皮肤标本，用羊抗人IgG、IgM、IgA及C₃荧光抗体染色，结果可见天疱疮9例中，取自“正常”组织标本均见表皮细胞间有IgG沉积，1例并有IgM、IgA，2例有C₃，7例毛囊上皮和（或）汗腺上皮细胞间有IgG、IgM、IgA、C₃沉积。用间接免疫荧光检测8例均阳性，大疱性类天疱疮8例中，取自“正常”皮肤标本均阳性，主要为基底膜出现IgG（7例），C₃（8例），1例为IgM，1例伴有IgA。天疱疮及大疱性类天疱疮均为自身免疫性疾病，皮肤及血液中分别存在抗表皮细胞表面抗体、天疱疮抗体及抗基底膜抗体-类天疱疮抗体，这些自身抗体结合在皮肤、粘膜的相应部位。

　　不同疱疮性皮肤病的间接荧光图形如表15-8

　　表15-8 皮肤抗体阳性荧光分布

　　（Clinical Immunology P146, 1971）

　　十五、唾液腺外分泌导管上皮自身抗体的检测

　　在诊断Sjogren’s综合征时检测唾液腺外分泌导管上皮细胞抗体具有重要意义，阳性率达65%，用人或猴唾液腺组织（O型）不固定的冰冻切片，间接免疫荧光细胞化学法检测，可见导管上皮细胞浆呈黄绿色荧光。

　　十六、抗横纹肌自身抗体的检测

　　抗横纹肌自身抗体出现在50%以上的肌无力症和胸腺瘤病人，正常人未发现。属IgG类抗体，用间接免疫荧光法检测此抗体，准确简便。

　　1．抗原切片取人或大白鼠骨骼肌，沿肌纤维平行方向作冰冻切片，不固定。

　　2．间接法免疫荧光染色方法染色的方法步骤与其他自身抗体间接法相同，但在荧光抗体染色之后，要延长PBS洗涤时间，3次PBS洗涤，每次30min。封裱切片。

　　3．荧光显微镜检查可见横纹肌A-带呈阳性荧光，无例外的都是胸腺肿瘤病人。单纯肌无力病人主要与I带和H带呈现阳性荧光有关。某些肌无力病人血清只含与“白纤维反应抗体，另一些只含有与”红纤维反应的抗体，呈斑点状荧光。横纹肌抗体和胸腺髓细胞、心肌呈一定程度的交叉反应。当血清稀释至1：60时，可获得更清晰的横纹荧光图像。

　　十七、肾上腺自身抗体的检测

　　抗肾上腺自身抗体是对肾上腺皮质细胞浆成分的一种器官特异性抗体。主要见于慢性肾上腺皮质功能减退症（阿狄森氏病）病人。用间接免疫荧光法检测，阳性率约50%，其他自身免疫病阳性率2%～5%。

　　1．抗原切片抗原用新鲜肾上腺尸检或手术切除标本，常用皮质醇增多症（柯兴氏病）病人手术切除的肾上腺。或取猴肾上腺组织，作冰冻切片。不需固定。

　　2．间接免疫荧光检查方法

　　3．荧光显微镜检查可见特异性荧光在皮髓质连接区最清晰，定位于皮质网状带细胞胞浆，髓质细胞不与抗体反应。

　　十八、类风湿因子（Rheumatoid factor）的检测

　　类风湿因子是一种抗轻度变性的IgG的自身抗体，可与人或动物的热聚合IgG或抗原结合的IgG（即免疫复合物中的IgG）反应，而不与正常IgG反应。类风湿因子为IgM类抗体。主要见于类风湿性关节　炎产现人血清和组织中。

　　1．直接法

　　（1）用病人关节　滑膜或淋巴结，冰冻切片，冷丙酮固定10min。

　　（2）标记变性IgG或球蛋白：取人血清提取的γ球蛋白（20～25mg/ml），按常规法标记FITC，去游离荧光素后，将标记溶液置63^℃水浴加热10min，使γ球蛋白热变性。加入40%2.17mol/L硫酸钠使热聚合体沉淀，置冰箱4h（4℃），然后在低温下离心30min（10000rpm）。取沉淀以预冷至4℃的蒸馏水溶解至原体积半量。用蒸馏水透析24h（4～6^℃），再用pH7.6生理盐水透析24h。高速离心（12000rpm）30min除去不溶性聚合物，取上清分装，-20^℃保存备用。

　　（3）直接免疫荧光染色：切片分别用以下染色试剂处理

　　①加标记变性γ球蛋白溶解。

　　②加标记抗IgM或γ球蛋白荧光抗体。

　　③加未标记变性γ球蛋白，作用切片后，洗涤，再加标记变性γ球蛋白。

　　①，②在适当稀释的试剂染色后呈特异性荧光，大多数活动性类风湿性关节　炎，可见阳性荧光的浆细胞堆集。③阴性或荧光显著减弱。

　　2．间接法用以检出病人血清中的类风湿因子。

　　抗原：用溶血素致敏的绵羊血细胞涂片。丙酮固定10min。

　　常规间接法染色。病人血清中有类风湿因子，与绵羊红细胞上的溶血素（变性IgG）结合，再加入γ球蛋白荧光抗体，与类风湿因子结合。因而红细胞呈现亮明的荧光，即证明类风湿因子阳性。

　　十九、抗中性白细胞胞浆自身抗体（Anti－eutrophil cytoplasmic autoantibody ANCA）

　　Davies 等（1982）首次报告在坏死性肾小球肾炎患者血清中发现ANCA。Hall等（1984）在4例系统性血管炎中也发现ANCA，其中3例表现为坏死性肾小球肾炎。Vander woude等（1985）报告血清中ANCA的滴度与诊断活动性Wegener氏肉芽肿的病情有密切关系，随着病情缓解，ANCA的滴度逐渐降低，所以认为是诊断Wegener氏肉芽肿很敏感的指标。随后一些研究表明检查ANCA对诊断结节　性多动脉炎和特发性新月体肾炎均有较高的敏感性。1989年和1990年分别召开了第一和第二届国际ANCA专题研讨会，引起了国际上的广泛重视。

　　ANCA抗原存在于中性白细胞的胞浆颗粒中，分子量为29kD，已证实是一种丝氨酸蛋白酶，与存在于中性白细胞嗜天青色颗粒中的丝氨酸蛋白酶-蛋白酶3（PR₃）十分相似。所以，胞浆型ANCA（C-ANCA）能与PR₃发生特异性反应。另一型称核周型ANCA（P-ANCA）的主要抗原成分是髓过氧化物酶（MPO），在坏死性肾小球肾炎和系统性血管炎患者，约90%的P-ANCA能与MPO发生特异性反应。由于有时P-ANCA同时伴有细胞核荧光，为排除假阳性，必须证明是MPO-ANCA。ANCA可以为IgG、IgM、或IgA类抗体，在不同疾病时三者的出现机率不同。

　　间接免疫荧光检查ANCA：用肝素抗凝血分离中性白细胞，以0.01mol/l Ph7.4 PBS洗细胞3次，制涂片，吹干。无水酒精固定5min。加待测血清，37℃孵育40min，PBS冲洗。加1：10稀释的抗人IgG-FITC荧光抗体，37℃孵育30min，PBS洗3次，每次3min，磷酸缓冲淮甘油封片。荧光显微镜观察。

　　ANCA的荧光可表现为C-ANCA和P-ANCA二种类型：C-ANCA荧光在胞浆中，分叶核之间有强的弥散性荧光、核无荧光。P-ANCA的荧光集中核周围，形成环状或不规则块状。

　　ANCA的致病机理：ANCA能使中性白细胞活化，发生呼吸爆炸，释放胞浆中的多种水解酶，氧自由基等活性物质而导致组织损伤。由于PR₃和MPO都带正电荷，它们能与肾小球基底膜结合，PR₃-ANCA和MPO-ANCA与之发生免疫反应导致肾小球基底膜损伤，另外，沉积在基底膜上的PR₃和MPO还能通过介导细胞免疫，参予肾组织损伤。

　　二十、增殖细胞核抗原抗体（Proliferative cell nuclear antigen antibody, PCNA）

　　培养细胞经促细胞分裂剂刺激，核内DNA开始合成G₀期，到最大增殖期（S期），细胞核特异的出现DNA的复制，利用这一特点，制成抗原DNA聚合酶S的辅助蛋白。取培养细胞或人末稍血淋巴细胞经PHA，ConA刺激后涂片，间接免疫荧光检测。结果可PHA刺激后48hDNA合成开始的S期出现很强的斑点型荧光，（G）期细胞无反应。

　　在SLE病人血清中出现有特异性诊断价值，出现率为3%～5%。

　　二十一、抗类风湿关节　炎相关核抗原的抗体（Antirheu－matoid arthritis associated nuclear antigen antibody, RANA）

　　又称SSC抗体，RAP，可有免疫荧光间接法检测，用人二倍体B细胞（Wil-2）或Raji细胞为抗原片，细胞滴片吹干，37℃干燥固定，因丙酮，乙醇等可使RANA失活。荧光阳性呈核内斑点型。对诊断类内湿关节　炎和伴有口眼干燥综合征的病人有参考意义。近年发现其他结缔组织病和正常人出率也很高，其特异性尚待进行深入研究。

　　二十二、抗精子抗体（Anti-sperm antibody, ASA）

　　在正常情况下由血睾屏障将精子抗原与免疫系统隔离，当此屏障发生破坏，精子抗原通过副睾间隙组织的淋巴管或毛细血管而进入免疫系统，就会引起自身免疫反应，产生自身抗体。抗精子抗体也可在一些女性体内产生。男性不孕症患者血中可检出很高阳性率的ASA。女性不孕症也可因ASA引起精子运动障碍，导致不孕。

　　抗精子抗体的作用是：①ASA可使精子运动障碍不能通过子宫颈管；②精子顶体酶活性被ASA抑制，使精子不易穿透包绕卵细胞的卵丘，放射冠和透明带；③抑制了精子与卵细胞膜的融合；④导致胚胎死亡和流产。⑤ASA的作用可使精子发生凝集，制动和结合三类。凝集抗体有精子头对头，尾对尾及混合型三种。

　　荧光抗体法和固相酶染色法常用于检测抗精子抗体。

　　固相酶免疫细胞化学方法：液化新鲜精液离心弃上清，沉积的精子用PBS洗3次，加0.5ml小牛血清混匀，校正精子浓度为5×10⁷ml，涂于载玻片上，室温自然干燥，甲醇固定10min，PBS洗2次，吹干，加被检血清，37℃湿盒，30min，PBS洗3次，每次3min，加酶标记抗人IgG抗体，免疫荧光法则加抗人荧光抗体，37^。C湿盒30min，PBS洗3次，每次3min（或荧光显微镜检查），用DAB-H₂O₂显色（同前述免疫酶细胞化学方法）。常规脱水、透明树胶封固。油镜观察结果。阳性反应精子呈棕黄色，阴性兰色（用伊文思蓝复染）。阳性可见在精子顶体、中体，后核帽、中片、尾及尾尖等。

　　二十三、其他自身抗体的检测

　　目前已发挥许多自身抗体，如抗胆小管抗体，见于原发性胆汁性肝硬化病人，阳性率达75%。用大白鼠肝的胆小管作抗原，间接免疫荧光染色阳性荧光定位于胆小管上皮细胞，呈均匀荧光。抗生殖细胞的自身抗体除精子外还有卵巢细胞抗体，常见不孕症患者。

　　心肌抗体常见于心脏手术后综合症和心脏移植的受体。

　　结肠粘膜抗体可见于溃疡性结肠炎患者的血清中，还有抗网织纤维抗体等。

　　近年对垂体细胞自身抗体研究发现，在多内分泌自身免疫疾病中存在抗促乳素细胞抗体，生长激素细胞抗体，ACTH细胞抗体等。

　　在神经系统中抗神经髓鞘成分的自身抗体，常见于神经脱鞘性疾病。

　　在一些眼科疾病中存在的自身抗体如抗晶体成分抗体，抗眼肌抗体等。

　　用大白鼠组织作抗原检查自身抗体，在心肌间质，肝枯否氏细胞，平滑肌和横纹肌模，胃及肾、肝的间质，肾小管近曲管刷状缘等出现阳性荧光，这是所谓异嗜性抗体（Heterophile anti－body），它和自身抗体易发生混淆，必须注意区分。

　　免疫细胞化学技术在自身免疫性疾病诊断中以免疫荧光技术应用最广泛，但应用免疫酶技术和免疫金-银技术也可以取得良好结果，作用用葡萄菌A蛋白的辣根过氧化物酶标记物代替荧光抗体作自身抗体检测，所得到的结果可用光学显微镜检查，适于在没有荧光显微镜的实验室应用。