第三节　结合和游离部分的分离

　　放射免疫分析时加入的抗原和抗体的量极微，反应所形成的复合物并不能成为肉眼所能辨认的不溶性沉淀物，但是放射免疫分析必须分别测量与抗体结合的（B）和游离的（F）抗原，所以，B、F的分离是放射免疫分析中的一个重要环节　。根据抗原—抗体复合物与游离抗原理化性质或免疫学性质的不同，可采取各种分离技术。

　　一、对分离方法的要求

　　分离方法的选择直接影响分析的质量，通常需满足以下要求：

　　①使B和F分离完全；②不受外界因素的干扰而影响分离效果；③与游离抗原的非特异性作用尽可能小；④操作简便，分离迅速，重复性好，适用于大量样品分析；⑤来源广，价格低廉，便于使用，适合RIA技术自动化。

　　二、常用的分离方法

　　目前用于放射免疫测定中的分离方法很多，各有其优缺点，下面介绍几种常见的分离方法：

　　（1）吸附分离（固相颗粒）

　　活性碳吸附剂（目前常用）

　　硅镁吸附剂（滑石粉等）

　　交换树脂吸附剂

　　（2）蛋白沉淀剂

　　硫酸铵、硫酸钠

　　聚乙二醇（PEG）（目前常用）

　　无水乙醇、丙醇等

　　（3）免疫分离剂（第二抗体）

　　（4）磁性分离剂

　　磁化活性碳吸附剂

　　磁化固相抗体

　　（5）固相包被分离法（固相分离剂包被在测试管内）

　　（一）吸附分离法

　　这种吸附分离剂是固相颗粒，它可以从反应液中吸附游离抗原。

　　活性炭是常用的吸附剂。活性炭多用于小分子游离抗原和抗原—抗体复合物的分离。具体应用时在活怀炭颗粒的表面涂上一层右旋糖酐或蛋白类化合物。这样活性炭末的表面构成一定大小的孔洞，在反应液中加入这种特殊颗粒的混悬液时，小分子的游离抗原被活性炭吸附，达到分离B与F的目的。

　　活性炭吸附方法的优点是操作简便、价廉，缺点是离心沉淀部分是F而不是B，不适用目前自动化放免测定，分离时易受温度和时间的影响。

　　（二）沉淀分离法

　　沉淀分离法的原理，是盐类或有机溶剂能够破坏蛋白质分子表面的水化层而发生沉淀（这种分离要求蛋白质分子处在等电点环境中）。常用的沉淀剂是聚乙二醇（PEG）。PEG是一种直链大分子聚合物，使用PEG溶液时分离沉淀是在有载体血清蛋白或丙种蛋白存在，而且要求γ球蛋白的最终浓度达250mg/ml以上的情况下才能实现。PEG沉淀的结果易受过量的脂类或离心温度的变化影响，PEG离心温度在20^℃以下进行。PEG沉淀的优点是PEG价格低廉，操作简便，一次可处理大量样品。其缺点是PEG单独使用时非特异结合高，所以常与其它方法联合使用；其分离效果易受pH、温度等影响。

　　（三）双抗体分离法

　　双抗体分离法也称免疫分离法，是特异性分离，应用十分普遍。本法是以抗IgG抗体和可溶性的抗原-抗体复合物结合，形成很大的复合物而沉淀。很多抗原的特异抗体来自家兔或豚鼠，称为第一抗体，形成的复合物不能通过离心将其沉淀。或将第一抗体的同种正常动物的血清IgG免疫另一种动物所制得的抗体为第二抗体，该抗体与第一抗体形成不可溶的复合物，经离心可将其沉淀，从而达到分离的目的（图8-6）。

图8-6　双抗体法分离原理模式图

　　第二抗体分离的优点是重复性好，B和F分离较为完全，非特异结合低，可同时处理大量样品，使用方便。缺点是分离时间长，非特异性结合可有较大的波动，第二抗体用量较大。

　　（四）磁性分离法

　　1975年，Hersh报道了用磁化分离技术分离血清狄高辛放免测定的B、F后，受到了广泛的重视。近年来国内外许多学者对磁化颗粒的制备进行了系统地研究，应用于B与F的分离，并取得了引人注目的进展，使放免的B、F分离不再使用离心，缩短了放免操作时间，便于放免自动化测量。磁性分离的具体原理为血清样品与标准品中的抗原与磁颗粒上的一定量的抗体反应，产生的抗原抗体磁性颗粒复合物，在磁场作用下沉降，使结合部分与游离部分分离。在磁性分离器上弃上清，进行测量。优点是简化了操作程序，B、F分离也较完全，稳定性好。

　　目前常用的磁性分离技术除磁性固相抗体外，还有磁化活性炭吸附分离剂。

　　（五）固相包被分离法

　　近年来由于固相技术的研究使其固相所被（埋）技术发展迅速，再有固相包被具有简便、快速、稳定、不需离心等优点，有逐渐取代液相法的趋势。

　　1990年，Causse报告了活化塑料管新技术及生物素结合抗体、亲和素标记物的应用，使放免技术对多数微量物质的检测可达到10^-15g级水平，大大提高了放免测定的精确度、灵敏度。

　　抗体包被：物理吸附法—方法简便，但包被量低。

　　价键结合法—需要纤维素、琼脂等固相载体，操作复杂。

　　Causse活化塑料管新技术，提高了包被量，主要特点是将顺丁烯二酸酐和苯乙烯的共聚体涂布试管，在试管壁形成一层活性薄膜（这种方法操作简便）。

　　（六）双抗体+PEG的分离法

　　这种分离方法利用双抗体特异性强、PEG沉淀简便快速的优点，从而克服了双抗体时间长、PEG方法非特异结合高的缺点。这一方面是当前分离技术中较理想的一种方法。

　　这种联合方法分离方法减少了第二抗体的用量，PEG的最终浓度也只需2～4%，成本较低。这种方法既适用于蛋白质、酶、大分子物质，又适用于小分子肽等半抗原物质。

　　1991年，北京中国同位素公司北方免疫试剂所采用80年代法国广泛应用的双抗体+PEG、再加一定剂量的γ球蛋白（免疫第二抗体时应用的γ球蛋白）的分离剂，溶解于磷酸缓冲液中，pH在7.4左右。这种分离剂推广应用产生了很好的效果。沉淀完全，牢固，而非特异性结合低，时间短（加入分离剂15min后即可离心），受温度影响小，受到用户的广泛好评。

　　以上方法，要依据反应液中反应物分子量大小，酸碱度等特点，选择合适的分离方法及分离剂。