第二节　葡萄球菌蛋白A（SPA）

　　葡萄球菌蛋白A（Staphylococal Protein A, SPA）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。早在1940年，Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双向扩散试验中能与正常人血清形成沉淀。Jensen（1959）也发现类似现象，并将其命名为A抗原。直到1963年Lofkvist等分离了该抗原，并证明它是一种蛋白质。为与A与糖相区别，Grov（1960）将其命名为葡萄球菌蛋白A，简称SPA或蛋白A（Protein A）。由于SPA的一些免疫特性，它已引起广大免疫学者的兴趣，并发展成为免疫学上一种极为有用的工具。

　　一、SPA的性质

　　（1）SPA存在于大多数（90%）金黄色葡萄球菌中，而不存在于表皮葡萄球菌中。并且主要存在于血浆凝固酶阳性菌株，而不存在于阴性菌株中。前者是致病的，后者是非致病的，但在体内研究中尚未发现SPA和菌株致病性之间有任何肯定的关系。不同菌株间的SPA含量有明显差异，以I株金黄色葡萄球菌含SPA量最高，SPA和细胞壁的肽聚糖呈共价结合。抗二甲氧基苯青霉素突变株（Methicillin—resistant strain）能产生分泌性SPA，它较之细胞壁所含的SPA在免疫学性质上相似，但易分离，损失少。

　　（2）SPA为蛋白质成分，仅含少量或不含碳水化合物，其分子量因提取方法不同而异，用脱氧核糖核酸酶消化细胞壁后超速离心或用加热油提法，所测分子量为12000～15000。用沉淀平衡分析和在6mol/L鸟嘌呤盐酸盐中凝胶过滤，测出分子量为42000。SPA为多肽单链，内含3个高度相似的Fc段结合区，每区由50个以上的氨基酸组成，不含色氨酸和半胱氨酸。其羧基末端是赖氨酸，氨基末端结构尚未肯定。SPA粘度高于球蛋白，等电点为pH5.1，其天然结构十分稳定，在应用6mol/L鸟嘌呤盐酸盐变性剂的条件下，尚能保存某些三级结构，如将此变性剂除去，则能自然矫正而恢复原有结构。

　　（3）SPA之所以引起免疫学家的重视，是因为它具有的免疫学特性。SPA具有和人与许多动物如豚鼠、猪、小鼠、猴等IgG结合的能力。SPA结合部位是Fc段而不是Fab段，这种结合不会影响抗体的活性。SPA具有的结合力是双价的，每个SPA分子可以同时结合两个IgG分子，也可一方面同IgG相结合，一方面与标记物如荧光素、过氧化物酶、胶体金和铁蛋白等相结合。还有一个饶有兴趣的事实是，和SPA结合后的IgG可用4mol/L鸟嘌呤盐酸盐等使之解离。SPA对IgG免疫球蛋白亚型的结合有选择性，如SPA与人IgG亚型：IgG1、IgG2、和IgG4有结合力，唯独不结合IgG3。只结合IgA2，而不结合IgA1。SPA和禽类血清IgG不结合。

　　（4）SPA具有多种生物学作用，如引起豚鼠解离体回肠和收缩，在吞噬反应中抑制IgG调理素吞噬和杀菌作用，SPA—Igg 复合物能固定人的补体和人、狗、猪的新鲜补体，对人类B细胞具有促有丝分裂因子的作用等。

　　二、SPA的应用

　　自70年代开始，国外应用SPA建立了许多敏感、特异性强、快速和简易的实验方法，并在许多方面的应用中积累了实际应用的材料，现已广泛应用到免疫学及其相关科学如细胞学、细菌学和病毒学等。其可能应用的范围可归纳为以下四个方面：

　　1．应用于免疫球蛋白的制备和分析　SPA是一种比较理想的提纯和分析免疫球蛋白的试剂。由于SPA与IgG及其某些亚型的Fc段有较强的结合力，可利用来提纯、分析免疫球蛋白制剂，结合后的PSA—IgG可再用解离剂如4mol/L尿素、4mol/L，硫氰酸盐或6mol/L的鸟嘌呤盐酸盐使之解离，多用SPA—Sepharose 层析柱分离IgG或其亚型及断片如Fc、Fab等。

　　2．应用于免疫细胞化学 　由于SPA具有双价结合力，在免疫细胞化学技术中可作为桥抗体或标记抗体。由于SPA能与多种动物的IgG的Fc段结合，因此，作为第二抗体或标记抗体，SPA的最大优点是不受种属特异性的限制，故在目前各种免疫细胞化学技术中已得到广泛的应用。除不受种属限制这一特点外，SPA法还具有染色时间短、灵敏性高和背景染色淡等优点。据报告用国产酶联SPA代替酶标记抗体，应用间接染色，时间较PAP法省时一半。SPA分子量小（13000～42000），易于穿透组织，而免疫球蛋白酶标记抗体为200000，PAP复合物为430000，均较SPA分子量大。

　　3．应用于多种细菌、支原体和病毒等病原体的简易快速诊断可应用SPA菌体作为载体，结合特异性抗体成为一种吸附原，作协同凝集剂，用于某些细菌和病毒的定群和分型（详见第二章　第三节　）。

　　4．可作为一种研究免疫复合物、膜抗原、膜受体和膜Ig的固相吸附剂　Hallgsen用同位素标记SPA测定血IgG的凝集物，发现85%全身性红斑狼疮和42%类风湿病人血清中凝集物增高。SPA用于细胞膜抗原、表面IgG和Fc受体的研究最大特点是能研究活细菌。Ghetie（1976）用SPA致敏绵羊红血球，与经IgG处理的细胞形成玫瑰花环，来鉴定带Fc受体的细胞，反之，如用SPA抑制玫瑰花环形成，则可定量测定细胞表面的IgG。应用SPA与胶体金或铁蛋白相结合，可在电镜水平检查抗原抗体反应的定位。特别是蛋白A—胶体金技术（Protein A—Gold technique, PGA技术）自Pomano和Romano（1977）首次报告用于标记细胞表面抗原、包括淋巴细胞、血小板、大鼠肾脏细胞及感染的病毒细胞获得成功以后，已得到愈来愈广泛的应用（详见第七章　），是一种较为理想的免疫电镜技术。

　　三、SPA在免疫细胞化学染色中的应用

　　SPA可为多种示踪物如荧光素、酶、胶体金、铁蛋白等所标记，应用较广的为酶标记SPA和金标记SPA技术，后者将在第七章　中叙述。标记SPA常用的酶为HRP。可应用于间接法。SPA在PAP法中可代替桥抗体。

　　1．SPA—HRP用于间接法的操作步骤

　　（1）切片经脱蜡后用0.5%H2O2—纯甲醇液处理5min以抑制内源性过氧化物酶活性。

　　（2）用Tris盐酸缓冲液（0.05mol/l pH7.6）洗2次，每次3min。

　　（3）以第一抗体血清覆盖处理切片，37℃，孵育30min，或4℃24～48h。

　　（4）用Tris-HCl缓冲液洗3次，每次5min。

　　（5）加SPA—HRP（1：100～1：400）处理30min。

　　（6）Tris-HCl缓冲液洗3次，每次5min。

　　（7）DAB—H2O2显色。

　　（8）复染、脱水、透明、封固。反应物为棕色。

　　2．SPA用于PAP法的操作步骤

　　（1）切片脱蜡至水洗。

　　（2）80%甲醇（含0.6%H2O2）封闭内源酶活性5min。

　　（3）10%卵白蛋白Tris缓冲液，20min。

　　（4）第一抗体作用37℃，30min或4℃ ，16～48h。

　　（5）0.05mol/l pH7.6 Tris-HCl缓冲盐液洗片5min。

　　（6）SPA（1μg/ml）5min。

　　（7）Tris-HCl盐液洗5min。

　　（8）PAP复合物（无种属限制），5min。

　　（9）Tris-HCl盐液洗切片5min。

　　（10）DAB（0.6mg/ml），加0.01%H2O2反应5min，然后水洗。

　　（11）复染：常用Mayer’s苏木精液数秒至1min（视需要而定），水洗。

　　（12）脱水、透明、封固、镜检。

　　3．SPA—HRP的制备 　应用Nakane和Kawaoi1974年建立的过碘酸法，酶：SPA=2：1，即HRP10mg,SPA5mg。

　　（1）10mg 溶于新鲜配制的pH8.1、0.3mol/L碳酸氢钠溶液1ml，加入0.1ml 1%二硝基氟苯无水乙醇溶液以封闭酶分子中的氨基，使不发生酶的自身聚合，室温轻轻搅拌1h。

　　（2）加入1ml0.04～0.08mol/L（依不同批号的酶而定）的NaIO4，室温搅拌30min。

　　（3）加入1ml0.16mol/L乙二醇，室温轻搅1h。

　　（4）对1000ml 0.01mol/L pH95 碳酸盐缓冲液充分透析（4℃，过夜），换缓冲液3次。

　　（5）加入5mg SPA的0.1mol/l pH7.4碳酸钠缓冲液1ml，室温轻搅2～3h。

　　（6）加5mg硼氢化钠（NaBH4）终止氧化，置4℃冰箱3h或过夜。

　　（7）对PBS透析24h，4℃离心去沉淀，半饱和硫酸铵洗沉淀结合物3次，溶于1ml 0.02mol/L pH7.4的PBS中。

　　（8）对PBS充分透析，经测定后分装，贮于-20℃冰箱中保存备用。

　　用过碘酸钠法可以得到很高标记率的HRP-SPA标记物，而且保存了抗体的全部活性，敏感度高，稳定性强，大大优于戊二醛标记抗体法，国内现在也有HRP-SPA的标记物供应，但要注意由于各家所用的SPA可能来源于不同菌株，在性质上可能存在一些差异。

　　【注意事项】

　　①在使用二硝基氟苯后，会产生氟化氢，应充分透析除净，否则抑制酶活性。

　　②标记时过碘酸浓度不宜过高，氧化时间不宜过长，否则会产生过度标记，即多个酶分子结合到一个蛋白A分子上。这些过度标记蛋白A的免疫反应性很差，容易产生非特异性染色。

　　③标记时加入酶与SPA的比例应适合，比值过大易产生过度标记，比值小则标记蛋白A产率低。

　　④过碘酸氧化结果能使酶具有多个醛基，从而能与多个蛋白分子的氨基相结合，成为一些大分子的聚合物。因此，有作者强调指出，对要求具有较强的细胞穿透力的免疫细胞化学实验时应予以考虑是否适用。但国内有实验室应用上海生物制品所产生的应用过碘酸氧化法制备的HRP—SPA于免疫电镜研究仍获得了较为满意的结果。